[发明专利]一种肝炎病毒基因检测方法

说明书

本发明涉及一种乙肝、庚肝病毒基因同步检测方法，适合正常人常规体检、临床肝炎病人或其病人的病原学检测。

乙型肝炎病毒(HBV)在人群中的感染率很高，是引起乙型肝炎和肝癌的主要病原。HBV是DNA病毒，主要通过血液及血制品传播，其检测主要依赖血清学(抗原-抗体反应)和病原学(HBV-DNA)检测。庚型肝炎病毒(HGV)是1995年底发现并开始研究的。该病毒为RNA病毒，与HBV有相似的感染途径(血循传播)，故两者共感染率高。其检测主要依赖HGV-RNA基因检测。由于两种病毒的基因结构完全不同，理、化性质也不相同，故到目前为止，国内、外报道的对两种病毒合并感染的早期诊断都是分别对两种病毒基因进行检测，其基本流程如下：

(1)取血→提取DNA→PCR扩增→特定DNA片段观察→诊断

(2)取血→提取RNA→RT→PCR→PCR→特定DNA片段观察→诊断

上述基因检测法敏感性强，特异性高。但存在以下问题：

1、检测时间长(费时)；2、检测步骤多(费力)；3、取血量较多4、试剂用量较大；5、易污染(提取步骤越多，越易污染)。

本发明的目的是提供了一种肝炎病毒基因检测方法，改变核酸提取液的pH值，能准确、快速、简便的检测各种病原体感染并能早期诊断。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

因为RNA与DNA在结构和理化性质上是不同的。RNA在碱性溶液中不稳定，其方案是：配制三种溶液，一种是采用异硫氰酸胍、枸橼酸钠、Sarcosul、巯基乙醇、醋酸钠、饱和酚按一定比例制配混合均匀，另一种是采用氯仿-异戊醇；再一种采用酵母tRNA。在酸性环境中先提取HCV-RNA；由于DNA适宜于在中、碱性环境中制备，在提取液中加入碱性缓冲液STE(氯化钠、Tris、EDTA)，改变提取液的pH值，在碱性环境中制备HBV-DNA。混合液中的酵母tRNA既能减少核酸的损失量，帮助核酸沉淀又有在下一步病毒核酸体外扩增中消除或减少逆转录酶对Tag酶的抑制作用。这种通过调整pH值同步制备DNA和RNA的方法，更简便、快速。在病毒核酸体外扩增中，对反应体系进行优化，调节逆转录酶与Tag酶的用量比(4．5∶1)、DNA与RNA的用量比、以及调节Mg离子用量(2．5mmol／L)等，可获得较好的效果并且能节约贵重试剂用量，从而达到快速诊断有无病毒感染的目的，并可同步检测多种(可达8种)病原体，包括病毒、细菌、寄生虫等。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果、该发明具有省时、省力、节约试剂和减少污染等优点(同步检测基因的数量、种类越多，其优点越明显)，且取血量少，被检者易接受；其敏感性、特异性、重复性与病毒基因单独PCR扩增结果一致；应用该技术对本地区106名吸毒者进行HBV和HGV感染的调查，得到了较为理想的结果。实验表明，该技术实用性强，准确、快速、简便，可用于HGV、HBV以及其他各种病原体感染的早期诊断。

实施例：

A、提取RNA和DNA：1、取血清100ul；2、加溶液，一种溶液是将4mol／L异硫氰酸胍、25mmol／L枸橼酸钠、0．5％Sarcosul、0．1mol／L巯基乙醇、2mol／L醋酸钠和一定量的饱和酚混匀取400ul；另一种溶液是氯仿-异戊醇40ul；再一种溶液是酵母tRNA20mg；2、离心取上清(保留剩余液体)；4、加2．5倍体积乙醇；5、沉淀溶于10ul水中，提取RNA；6、加STE于保留的剩余液体中；7、离心取上清；8、加2倍体积乙醇；9、沉淀溶于10ul水中，提取DNA。

B、病毒核酸体外扩增

反应体系：HGV-RNA       10ul    94℃     4min

          引物1．3各     1ul    94℃     45sec

       AMV、Taq(4．5∶1) →     50℃     45sec   35Cyc

         总体积 25ul            72℃     45sec

            42℃1h              72℃     7min

取上述反应物              3ul   94℃     4min

   HBV-DNA                10ul  94℃     45sec

引物1．2．4．5各          1ul→ 57℃     45sec   30Cyc

Taq酶                   2u／1ul 72℃     45sec