[发明专利]血清1,5－脱水葡萄糖醇测定试剂

说明书

本发明涉及生化技术及生物化学检验技术，特别是用于体外定量测定血清中血清1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)含量的检测技术。

1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)可作为糖尿病患者早期诊断灵敏特异性指标，亦可作为糖尿病治疗和愈后观察的评价指标。现行糖尿病诊断指标有明显不足，空腹血糖测定不灵敏，其决定水平难以定论，尤其对于Ⅱ型糖尿病病人漏诊率高；口服糖耐量试验虽可动态观察血糖的变化，但操作麻烦，对于已明确诊断患者，在治疗、愈后观察中采用，危险性大，且易诱发高血糖危象；糖化Hb虽然是一种早期诊断指标，但它是一项半定量分析，不能满足临床需求。

本发明的目的是提供一种测定血清中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)含量的检测试剂，使其具有操作简便、安全，具有特异性高、灵敏度、能消除血样中多羟醇的干扰、单项测定即可早期诊断Ⅰ、Ⅱ型糖尿病以及观察治疗其预后等特点。

本发明检测试剂的检测原理是：吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-AG生成1，5-脱水果糖和H₂O₂；氨替比啉(4-ΛΛP)、二氯苯酚(DCP)和H₂O₂反应，在过氧化物酶(POD)催化下生成醌类化合物(红色)；利用比色分析原理可以得出1，5-AG水平。

本发明提供的测定血清中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)含量的检测试剂包括试剂Ⅰ和试剂Ⅱ两个部分，试剂Ⅰ是含有丙酮酸激酶、葡萄糖激酶、维生素C氧化酶、三磷酸腺苷、磷酸烯醇丙酮酸、4-氨基安替比林、氯化镁、氯化钾和醋酸盐缓冲液的溶液；试剂Ⅱ是含有吡喃糖氧化酶、辣根过氧化物酶、苯酚、醋酸盐缓冲液的溶液。试剂Ⅰ、试剂Ⅱ中各组分的含量是：

试剂Ⅰ(每升试剂Ⅰ溶液中各组分的含量)：

丙酮酸激酶(PK)      2-6ku，

葡萄糖氧化酶(GK)    1-8ku，

维生素C氧化酶       1-10ku，

三磷酸腺苷          1-2mmol，

磷酸烯醇丙酮酸(PEP) 1-10mmol，

4-氨基安替比林      2-3mmol

氯化镁              1-10mmol

氯化钾              5-100mol

醋酸盐缓冲液        100-300mmol

试剂Ⅱ(每升试剂Ⅱ溶液中各组分的含量)：

比喃糖氧化膦           10-200ku，

辣根过氧化物酶(HRP)    5-40ku，

苯酚                   15-30mmol

醋酸盐缓冲液           100-300mmol

使用本发明提供的检测试剂测定血清中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)含量，具有操作简便、安全，具有特异性高、灵敏度高等特点，其试剂Ⅰ与待测样本作用5分钟后即可消除血样中多羟醇的干扰，故有效提高了本发明试剂检测的特异性和准确度；本发明试剂的精确度日内CV为0．5-0．8％，对糖尿病，尤其潜在型病例的诊治提供可靠诊断依据，是单项测定即可诊断和判断Ⅰ、Ⅱ型糖尿病预后的检查方法。

实施例

1．制备检测试剂

取：

丙酮酸激酶      3ku

葡萄糖激酶      4ku

维生素C氧化酶   5ku

三磷酸腺苷 1．0mmol

磷酸烯醇丙酮酸 4．0mmol

4-氨基安替比林 1．5mmol

氯化镁 7．5mmol

氯化钾  5．0mol

醋酸盐缓冲液  200mmol

配制成1升溶液制成试剂Ⅰ；

取

吡喃糖氧化酶 100ku

辣根过氧化物酶 10ku

苯酚 22mmol

醋酸盐缓冲液 200mmol

配制成1升溶液制成试剂Ⅱ。

2．制备1，5-脱水葡萄糖醇标准品：称所需量纯品(购于Sigma公司)溶于生理盐水中，并加1‰叠氮钠作防腐剂，封密保存备用。