[发明专利]中国棉铃虫病毒基因工程株1号

说明书

本发明是中国棉铃虫病毒基因工程株1号，属生物技术领域。可用于害虫的生物防治及病毒流行病学研究

以杆状病毒为代表的昆虫病毒由于其高度专一性，极强的致病性以及对环境的安全性已广泛用于农业害虫的生物防治。到目前为止国际上登记注册的病毒杀虫剂已超过20种，我国也有中国棉铃虫病毒杀虫剂，斜纹夜蛾病毒杀虫剂和小菜蛾颗粒体病毒等3种病毒杀虫剂登记注册进入商品化生产。在生产上发挥了重要作用。但野生型病毒存在杀虫速度慢(一般需要5-7天)，杀虫谱窄等缺陷而限制了其更大规模的应用。随着杆状病毒分子生物学研究和生物技术的发展，通过基因工程的方法改良病毒的杀虫性能成为现实。

目前改良病毒杀虫速度的方法有删除或失活病毒自身的特定基因如egt，pp32等、表达昆虫的激素基因和酶以及表达毒素基因如Bt毒素基因、昆虫特异性的神经毒素基因如AaIT等。其中以缺失病毒egt基因和表达昆虫神经毒素基因AaIT的改良效果最为理想。

国际上已经和正在进行遗传改良以提高病毒杀虫速度的昆虫杆状病毒有：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)(美国，英国等)，舞毒蛾核型多角体病毒(LdMNPV，美国)，黄杉毒蛾核型多角体病毒(OpMPNV，美国)，云杉卷叶蛾核型多角体病毒(CfMNPV，加拿大)，甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV，荷兰)，海灰翅夜蛾核型多角体病毒(SINPV，以色列)，美洲棉铃虫(HeSNPV)(美国)等。我国也有多家实验室正在从事相关研究，其中中山大学的主要研究对象为AcMNPV和斜纹夜蛾核型多角体病毒(S1MNPV)，武汉大学的研究对象为AcMNPV。到目前为止，国内外尚未见通过基因工程方法改良中国棉铃虫病(Heliothis armigeranucleopolyhedrovirus,HearNPV或HaNPV)杀虫性能研究的报道(见查新报告)。

中国科学院武汉病毒于1973年在湖北分离获得中国棉铃虫病毒，成功的研制了HaSNPV杀虫，并已于1995年登记注册成为我国第一个商品化生产的病毒杀虫剂，每年的防治面积达200万亩次。但这仅占我国控制大面积棉铃虫危害所使用的农药的极少部分(主要农药仍为化学农药)主要原因是棉铃虫病毒和所有其它杆状病毒一样：杀虫速度慢。因此，如何提高棉铃虫病毒杀虫剂的杀虫速度成为该杀虫剂推广应用的关键。

本发明专利的目的是通过基因工程的方法对中国棉铃虫病毒株进行遗传改造，提高其杀虫速度，为病毒杀虫剂的生产提供一株高效的工程病毒株。

为了获得高效的棉铃虫病毒基因工程株，本发明采用了缺失HaSNPV自身egt(蜕皮激素UDP葡萄糖基转移酶)基因的技术路线。昆虫病毒遗传工程株构建方法是构建重组转移载体，转移载体与野生型病毒共转染敏感的昆虫细胞，通过同源重组产生重组病毒，然后空斑纯化重组病毒；最后对重组病毒的性能进行分析。

和野生型棉铃虫核型多角体病毒相比较，经过遗传改良所获得的中国棉铃虫病毒基因工程株1号的杀虫速度比野生型病毒有了明显的提高，其LT₅₀缩短20％，该重组株用于棉铃虫的防治将明显优于野生型病毒。

另外本工程株含有GFP(绿色荧光蛋白)标记基因，因而还特别适用于病毒田间流行病学的研究。

实施例：

1．首先构建含有HaSNPV egt基因的转移载体pHaGFPegt：将含有HaSNPVegt 5’端及其上游序列的1.7kb片段和3’端及其下游序列的2.1kb片段克隆到pKS载体质粒的适当的限制性内切酶位点，GFP标记基因(由病毒的多角体蛋白基因启动子控制)插入两片段之间构成重组的转移载体pHaGFPegt^-。该转移载体包含有HaSPNV egt基因5’和3’端及上下游侧翼序列，egt基因的主要编码区被GFP标记基因取代。

2．pHaGFPegt^-质粒DNA与HaSNPV(野生型)DNA共转染敏感昆虫细胞Hz-AM1，来源于HaSNPV的序列和野生型病毒DNA发生同源等位交换产生重组病毒。该重组病毒的egt基因大部分编码区被GFP标记基因取代。由于GFP的表达，感染了重组病毒的细胞在紫外灯下产生绿色的荧光。

3．空斑挑选产荧光的重组病毒，经3-5轮空斑可获得纯化的重组病毒。

4．重组病毒的检测

1)．限制性内切酶消化分析

2)．PCR分析

3)．EGT酶活性分析确认基因已被删除。

5．生物活性测定

以3龄中国棉铃虫为供试幼虫，以1x10⁶PIB/ml的病毒为供试浓度，测定比较野生型和重组型的LT₅₀。