[发明专利]耐氨性的L(+)－产乳酸菌及生产L(+)－乳酸的方法

说明书

本发明涉及属于根霉菌属的、具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌及使用该菌种生产L(+)-乳酸的方法，更详细的说是涉及用亚硝基胍使作为母株的根霉MK96(Rhizopus sp.MK96)变异得到的具有耐氨性的L(+)-产乳酸菌，也就是说，涉及根霉MK96-1156本身及用它们在有氧的条件下以氨气作为中和剂调节培养液的pH，从而高收率地制备L(+)-乳酸的方法。

乳酸可以作为食品添加剂用于酒类、清凉饮料、咸菜、酱油、面包、啤酒等的制备中，此外，在皮革、纤维、塑料等工业中也被利用，是一种有用的化合物。

目前，用发酵法生产乳酸，一般是将属于裂殖菌类的乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)等被称作乳酸菌类的菌在无氧的条件下培养，进行乳酸发酵。乳酸菌的培养过程中使用的培养基是以糖、淀粉等作为主原料，并向其中添加作为副原料的酵母提取物等营养源。利用这些乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)等菌进行的乳酸发酵具有过程简单，且乳酸收率高的优点，但是一般来说，因为酵母提取物等副原料的价格高，所以得到的L(+)-乳酸的价格也就高。另外，由于这些菌的大小均为1μm以下，与培养基的分离比较困难，培养处理的操作性差。

另一方面，也有使用根霉菌属类的丝状菌在含有碳酸钙的培养液中通过有氧培养生产乳酸的方法。从糖得到乳酸的收率在70-80％，由于葡萄糖等单糖能够作为碳源，而且培养基的成份除糖以外只要求少量的无机盐，所以发酵后培养基中的杂质比较少。例如，Kristofikova等(L.Kristofikova，M.Rosenberg，，A.Valnove，J.Sajbidor及M.Certik Folia Microbiol，36(5)，451-455(1991))以葡萄糖作为碳源，由无根根霉CCM8109(Rhizopusarrhizus CCM8109)生产79克/升乳酸。

另外，也有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzae NRRL395)菌体生产乳酸的方法。例如，Yang等(C.W.Yang，，Zhongjing Lu及Geroge T.Tsaso；ApplidBiochemistry and Biotechology vol.51/52 p57-71，1995)描述的方法是在有氧的条件下，用添加了碳酸钙的培养液培养该菌体，得到收率为78％的乳酸。

另外，上述根霉菌属的菌体容易形成聚集体(粒状沉淀)，由于能够简单的与培养基分离，所以容易从发酵后的培养基中分离纯化乳酸和该粒状沉淀。利用了这种粒状沉淀的优点的方法，有使用米根霉NRRL395(Rhizopus oryzaeNRRL395)，在以木糖作为碳源的培养液中使之形成菌体粒状沉淀，用该粒状沉淀由葡萄糖生产乳酸的方法。例如，Soccol等(C.R.Soccol，B.Marin，M..Raimbault；Appl Microbiol Biotechnol 41，286-290(1991))在有氧的条件下，在含有中和剂碳酸钙的培养液中发酵培养得到的菌体粒状沉淀，得到收率约为75％的乳酸。采用这种方法，在含有碳酸钙的培养液中培养该粒状沉淀，通过每次消耗完作为碳源的葡萄糖后再在新的培养液中培养，可以连续的生产乳酸。

这样，在有氧的条件下培养根霉菌属的菌株，以葡萄糖和淀粉为原料生产L(+)-乳酸时，与使用乳酸菌的场合相比，具有多种优点。

但是，在有氧的条件下培养根霉菌，产生乳酸的收率一般比较低，而且发酵大多需要7-10天，生产乳酸的时间长。因此，与使用乳酸菌在无氧条件下的发酵比较，缺乏工业实用性。

另外，虽然上述Soccol等也报告了再次使用根霉菌的连续培养，但是使用该菌株时，3次以后乳酸的产量大大降低，为了防止这种事情的发生，就必须向培养液中添加尿素作为氮源。