[发明专利]转基因胡萝卜生产的霍乱疫苗及其方法

说明书

本发明涉及植物基因工程领域。具体地说是通过转基因胡萝卜生产霍乱疫苗，利用转化的胡萝卜下胚轴分化为完整植株，转基因胡萝卜生产霍乱毒素B亚单位(CTB)，制备具有生物活性和实用的霍乱口服疫苗。

随着植物基因工程技术的发展，转基因植物能够表达多种蛋白质，包括来源于动物、人类、病毒和细菌等的蛋白质。而利用植物表达口服疫苗更有利于疫苗的分装和服用；在植物的果实或疏菜中表达多肽疫苗，这只需将种子运输到各地，再繁殖出植物的可食部分即可直接应用，从而可大大简化疫苗的贮藏和分装。因此利用植物表达系统生产安全、廉价、实用的口服疫苗，更有利于口服疫苗的推广和肠道传染病的预防^[6]。

目前大多使用模式植物表达多肽疫苗，如烟草、马铃薯等，这些植物表达的多肽疫苗不能直接口服，需经纯化后才能使用；而选用能够生吃的植物的组织或果实(如水果和蔬菜)生产口服疫苗，这样才能发挥植物表达系统的作用^[6]。在许多可以生吃的植物中，胡萝卜具有重要的经济价值和实用价值，它的种植范围比较广，能够满足大量生产外源蛋白的需要；胡萝卜还含有丰富的维生素，在预防疾病的同时又可增加营养。因此，胡萝卜生产口服疫苗具有重要的意义。在植物生产霍乱疫苗方面，Hein等只获得了表达CTB的转基因烟草，对CTB活性未作分析^[5]。Arakawa等用马铃薯表达的CTB不能生吃，而加热煮熟后CTB的活性大大降低^[1，2]；这些研究都未能获得有实用价值的CTB植物生产系统。

在改进作物品质或生产异源蛋白方面，转基因方法已成为重要的手段。在已有的胡萝卜转化方法中，大多采用培养细胞作为转化的受体材料，如愈伤组织、悬浮细胞等^[3，7，9]。由于这些材料不易被根癌农杆菌侵染，转化效率较低，并且悬浮细胞培养需要较严格的无菌培养条件，不利于操作。也有用胡萝卜下胚轴作为转化的受体材料^[4，8]，但转化的胡萝卜下胚轴再生的愈伤组织须经过悬浮细胞培养才能再生植株，转化方法复杂并且周期长。在已报道的这些胡萝卜转化方法中，转化的胡萝卜细胞再生成植株都要通过体细胞胚胎发生过程。因此，这些胡萝卜转化方法还不够完善，制约了胡萝卜在基因操作方面的研究进展。

本发明的目的在于提供一种口服疫苗的生产方法。即利用转基因胡萝卜生产CTB，通过表达载体的构建、胡萝卜的转化、CTB的表达分析生产具有生物活性的CTB。本发明的另一目的在于提供一种简便的胡萝卜转化方法，即根癌农杆菌与胡萝卜下胚轴共培养后，转化的胡萝卜下胚轴直接分化形成再生植株。本发明克服了现有技术的缺陷，选择能够直接生吃的胡萝卜生产霍乱疫苗，即将霍乱疫苗基因表达在胡萝卜的可食部位，通过口服胡萝卜的直根，可达到预防和治疗疾病的目的。

本发明的具体实施步骤如下：

以pUC-CTB质粒为模板，根据已报导的CTB编码区5’端和3’端序列设计并合成一对引物，通过PCR扩增CTB基因。纯化PCR产物连接到pGEM-T载体并转化大肠杆菌XL1-Blue，获得含CTB基因的重组质粒pGEB。测序表明CTB基因与霍乱弧菌569B株的CTB原始序列相同。将CTB基因的5’端与烟草病程相关蛋白PR1b信号肽序列同框融合，获得pRBC重组质粒。

从重组质粒pRBC分离出含PR1b-CTB融合基因的DNA片段连接到植物组成型表达载体pBin438，连接物转化大肠杆菌XL1-Blue获得能在植物中组成型表达的重组质粒pBirc38及重组大肠杆菌XL1-Blue-pBirc38。

从上述重组大肠杆菌中提取重组质粒pBirc38，转化农杆菌LBA4404，获得重组农杆菌LBA4404-CTB。用重组农杆菌介导法转化胡萝卜下胚轴，通过选择培养，获得了抗卡那霉素植株。植株叶片总DNA的PCR分析表明得到了含CTB基因的植株。Western blot分析表明转基因胡萝卜能够表达CTB蛋白。ELISA分析证明CTB能够在转基因胡萝卜根部和叶片中有效表达。GM1结合的阻断试验表明胡萝卜中表达的CTB形成五聚体，CTB能够有效地与GM1神经节苷酯结合。结合附图对本发明作进一步详细描述：