[发明专利]人类液泡膜型腺苷三磷酸酶D亚基编码基因pRb－BP76

说明书

本发明涉及与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76及它在人体各组织中的表达和在染色体上的定位，以探索肿瘤诊断和治疗的新途径。

Rb基因是人类报道最早的肿瘤抑制基因，其正常的编码蛋白不仅是一种重要的细胞增殖抑制因子，还广泛参与了细胞分化、细胞凋亡、抑制肿瘤形成等多种复杂的生理过程(Mulligan，G.，TIG，1998，14：223-229；Knudsen，E.S.et al.，Genes & Dev.，1998，12：2278-2292；Luo，R.X.，etal.，Cell，1998，92：463-473；Macleod，K.，Curr.Opin.Genet.Dev.，1999，9(1)：31-39)其核心环节就是DNA与蛋白质，蛋白质与蛋白质相互作用，Rb发生作用主要是通过影响转录来实现的，它通过与多种转录因子的相互作用对转录发生正调控或负调控。

正常的Rb具有抑癌功能，但Rb基因的一些缺失或突变所造成的突变体由于丧失了对细胞增殖、分化等的正常控制而导致细胞癌变。常见的由于Rb突变所导致的肿瘤有视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、前列腺癌和膀胱癌(Paggi，M.G.，et al.，J.Cell Biochem.，1996，62：418-430)。此外，Rb还是一些小的DNA肿瘤病毒的病毒抗原(如腺病毒的E1A蛋白、SV40的大T抗原)的早期作用因子。因此，Rb与各蛋白质因子之间的相互作用显得尤为重要，已成为人们注意的焦点。过去几年来，人们已经克隆了许多编码产物能够与pRB相作用的基因(Weinberg，R.A.，Science，1991，254：1138-1146；Cavanaugh，A.H.，et al.，Nature，1995，374：177-180；Wang，C.Y.，et al.，Science，1993，260：1330-1335；Dunaief，J.L.，et al.，Cell，1994，79：119-130；Woitach，J.T.，et al.，Nat.Genet.，1998，19(4)：371-374；Simons，A.，et al.，Oncogene，1997，14(2)：145-155)，一方面研究这些因子的结构特征，寻找它们与pRB的作用规律，另一方面致力于研究它们的功能。这两方面的研究为阐明pRB参与细胞各项生理过程的调控机制奠定了基础。同时研究Rb与其他蛋白质因子的相互作用，有助于探讨肿瘤的发病机制，为肿瘤的诊断和治疗提供新的设想和方案。

酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种在体内研究蛋白质之间相互作用的体系(Chien，C.T，et al.Proc.Acad.SCi.USA，1991，88：9578-9582)该系统的原理是基于酵母中的一种转录因子GAL4功能的重建。GAL4分子含有两个相对独立的功能域：DNA结合区和转录激活区。把欲验证存在相互作用的两个蛋白质(X和Y)的基因分别与GAL4的DNA结合区和转录激活区融合，再将这两个融合表达载体转入特殊的酵母细胞中，此酵母菌的染色体上，已整合了可被GAL4的DNA结合区所识别并结合的位点及下游报告基因(HIS3或LacZ)，如果两个蛋白质之间发生相互作用，报告基因就能表达。蛋白质Y也可是一个基因文库，这样就可以从中筛选与蛋白质X相互作用的新蛋白质基因。

为此，本发明的目的是提供一种能与抗癌基因编码产物pRB相作用的人体蛋白质编码基因pRb-BP76全长cDNA序列，并表明它在8种正常人组织中的表达水平及在染色体上的定位，在肿瘤的诊断和治疗上具有潜在的应用意义。

本发明是一种与抗癌基因编码产物pRB相作用的人类新基因pRb-BP76，它是根据上述情况，利用pRB融合GAL4的DNA结合区，作为蛋白质X，以人胎脑cDNA文库融合GAL4的转录激活区为蛋白质Y，筛选到了一个人类新基因pRb-BP76。经PCR方法钓到了全长cDNA片段，测定了全序列，并进行了染色体定位和在8种正常人组织中的Northern杂交分析，为研究pRB的作用原理开辟了新的途径。