[发明专利]葡萄糖传感器

说明书

本发明涉及能够迅速且简便地对试样中的特定组分进行高精度定量的葡萄糖传感器。本发明更具体涉及以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖传感器所用的葡萄糖脱氢酶的稳定化方法及稳定的葡萄糖脱氢酶组合物。

以往，作为不对试样溶液进行稀释和搅拌等，就可简便地对试样溶液中的特定组分定量的方式，提出了各种生物传感器。以下是生物传感器的一个例子(日本专利公开公报平2-062952号)。

该生物传感器包括通过网版印刷等方法在绝缘性基板上形成的由工作电极、配极和参考电极所构成的电极系统，以及在该电极系统上形成的包含亲水性高分子、氧化还原酶和电子接受体的酶反应层。

如果在以上制作的生物传感器的酶反应层上滴下包含底物的试样溶液，酶反应层就会溶解，酶与底物便发生反应，与此同时电子接受体被还原。酶反应结束后，被还原的电子接受体发生了电化学氧化，由此时获得的氧化电流可求得试样溶液中的底物浓度。

利用上述生物传感器，理论上根据作为测定对象的底物来选择不同的酶，这样便可对各种物质进行测定。

例如，选择了葡萄糖氧化酶为底物酶，就能够制得对试样溶液中的葡萄糖浓度进行测定的葡萄糖传感器。

通常，上述构成的生物传感器中的酶在传感器中保持干燥状态，由于酶的主要成分为蛋白质，所以，如果与空气等中的水分长期接触，就有出现变性的危险。此外，在极端情况下，还有酶失活的危险。

因此，如果长时间保存传感器，有时会出现酶活性降低、与底物反应的酶量不足、所得应答电流值与底物浓度不成比例的情况。

而且，一般即使在传感器内导入底物浓度为零的试样溶液，也能够获得一定的传感器应答电流值(以下称其为“空白值”)。获得该空白值的原因之一是，被导入传感器的可溶解反应层的试样溶液中的离子滞留在基板上的电极表面，引起了电极反应。如果空白值较大，由于应答电流值和底物浓度的相关性降低，所以，不能够对底物进行正确的定量。

因此，为了获得保存稳定性良好、空白值较小的生物传感器，很重要的一点是在酶周围创造一个可长期保持酶活性的环境。另外，在基板上的电极表面附近创造一个可使空白值小到忽略不记的环境也是相当重要的。而且，为使酶反应时电子和底物的移动顺利进行，有必要提高传感器的应答性。

为了解决上述问题，以往采用的方法是在反应层中添加磷酸等添加剂。

另一方面，为了制得高性能的葡萄糖传感器，以往使用的酶是以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶(以下称其为“PQQ-GDH”)。使用了PQQ-GDH的葡萄糖传感器中，由于PQQ-GDH的催化反应与氧无关，所以，具有酶反应完全不受血中等溶存氧的影响的特性。因此，利用该葡萄糖传感器测得的值不会因试样溶液中的氧分压的变化而出现误差，也就是说，能够获得高性能的传感器。

但是，使用PQQ-GDH酶时，即使在反应层中添加前述磷酸等添加剂，也不能够获得足够小的传感器应答电流空白值，而且，存在不能够充分提高保存稳定性的问题。

鉴于上述问题，本发明的目的是提供保存稳定性较高、空白值较小的高性能葡萄糖传感器。本发明的另一目的是提供PQQ-GDH的稳定化方法，以及稳定的葡萄糖脱氢酶组合物。

本发明的葡萄糖传感器的特征是，在具备电绝缘性基板，设置在前述基板上的至少由工作电极和配极构成的电极系统，以及连接在前述电极系统上或形成于其附近的至少包含以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶的反应层的葡萄糖传感器中，在前述反应层中添加了选自苯二甲酸、苯二甲酸盐、马来酸、马来酸盐、琥珀酸、琥珀酸盐、三乙醇胺、三乙醇胺盐、柠檬酸、柠檬酸盐、二甲基戊二酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸盐、三(羟甲基)甘氨酸、三(羟甲基)甘氨酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐、咪唑及三甲基吡啶中的至少1种添加剂。

这里，前述酶最好被前述添加剂覆盖。

本发明还涉及葡萄糖传感器用葡萄糖脱氢酶的稳定化方法，该方法的特征是，在以吡咯并喹啉醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶中添加了选自苯二甲酸、苯二甲酸盐、马来酸、马来酸盐、琥珀酸、琥珀酸盐、三乙醇胺、三乙醇胺盐、柠檬酸、柠檬酸盐、二甲基戊二酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸盐、三(羟甲基)甘氨酸、三(羟甲基)甘氨酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷、三(羟甲基)氨基甲烷盐、咪唑及三甲基吡啶中的至少1种添加剂。