[发明专利]能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种能精确识别细胞间差异的新型抗体的制备方法，特别是涉及一种能精确识别同一生物个体的肿瘤细胞与正常细胞及骨髓细胞间差异或肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞间差异的新型抗体的制备方法。

在生物医学领域中，抗癌抗体的识别功能及其制备方法对于肿瘤的诊断、治疗和预防都有着十分重要的意义，因而受到国内外生物医学界的广泛关注，开展了大量的研究工作并取得了一定的进展。传统的制备单克隆抗癌抗体的方法主要包括三个步骤，即获取肿瘤细胞相关抗原、免疫小鼠和溶合杂交瘤。

一般来说，起源于同一组织的肿瘤细胞与正常细胞间的差异是很小的。因此，制备用于治疗肿瘤的抗癌抗体时，必须反复筛选出与非肿瘤细胞交叉免疫反应最弱的抗体，以尽量避免抗癌抗体对正常细胞的损伤。然而，采用传统方法制备单克隆抗癌抗体却很难做到这一点，究其原因主要有以下两方面。首先，抗癌抗体与正常细胞交叉免疫反应的强弱，不仅取决于肿瘤细胞相关抗原是否纯化，而且与抗原的表位结构有关，肿瘤细胞相关抗原与正常细胞抗原的表位结构越相似，则所制备的单克隆抗癌抗体与正常细胞发生交叉免疫反应的可能性就越大。在这方面，传统的制备单克隆抗瘤抗体的方法可谓先天不足。其次，采用传统方法制备的单克隆抗癌抗体没有经过个体早期胸腺和骨髓克隆选择过程，对受者而言，这样的外源性单克隆抗癌抗体就不能选择性识别其肿瘤细胞抗原决定簇中的突变点，也不能经宿主调节以此点形成免疫优势位点来区分“自身”与“非已”。正是由于以上两方面的原因，在很大程度上制约了各种单克隆抗癌抗体的发展，采用传统方法制备的单克隆抗癌抗体很难完全避免与正常细胞发生交叉免疫反应。

为了提高抗癌抗体对肿瘤细胞的特异性识别功能并避免对正常细胞的损伤，发明人王胜军在98100700.7发明专利申请中公开了一种能全方位选择性识别肿瘤细胞的多克隆抗癌抗体的制备方法，该制备方法主要包括建立“天然”免疫耐受、免疫小鼠、检测和溶合杂交瘤四个步骤。由于不需要体外扩增和纯化肿瘤抗原，因而该制备方法相当简便易行。所制备的多克隆抗癌抗体携带有起源于同一个体同一组织的正常细胞与肿瘤细胞间的全部抗原差异信息，因而具有全方位选择性识别肿瘤细胞的功能，它只与肿瘤细胞发生免疫反应，而不与正常细胞发生交叉免疫反应。可以说，上述制备多克隆抗癌抗体的方法已经在很大程度上克服了传统方法的缺陷和弊端。但是，上述制备方法在某些方面也还存在一定的局限性。

首先，在上述制备方法的建立“天然”免疫耐受的过程中，导入异品系或杂交鼠B的胚胎b中的正常细胞，仅限于患有肿瘤的纯系小鼠a的与肿瘤细胞起源于同一组织的正常细胞，而不包括其它组织的正常细胞，尤其是没有包括骨髓细胞。这一点势必将影响建立“天然”免疫耐受的有效性并最终影响到抗癌抗体识别肿瘤细胞的准确性。事实上，有证据表明，肿瘤细胞处于未分化或低分化的分子生态环境中时，可能会表达与其它组织细胞相同的抗原，如结肠癌细胞表达与骨髓细胞相同的抗原，胃癌细胞表达血型抗原等。而且，利用骨髓等淋巴造血细胞表达同种抗原更有利于“天然”免疫耐受的建立。

其次，以肿瘤组织血管内皮细胞表达的特征性分子为靶的治疗方法在肿瘤的导向治疗中已占据十分重要的地位，这是因为肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤新生血管的形成有着十分密切的关系。实验表明，当肿瘤生长到0.2～0.3mm大小时，如果不通过其血管供应营养，则肿瘤细胞将停止生长并被“饿死”，肿瘤细胞也不能经血液而转移。遗憾的是，采用传统方法制备的多克隆抗体或单克隆抗体都不能十分有效地选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞与正常组织血管内皮细胞之间的全部差异点，而采用98100700.7发明专利申请公开的方法制备的多克隆抗体或单克隆抗体又只能选择性识别肿瘤细胞，而根本不能选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞，这种情况无疑也会给肿瘤的导向治疗带来一定的限制。试想，如果能有某种能准确识别肿瘤组织血管内皮细胞表达的全部特征性分子的多克隆抗体和以这种抗体可变区为模板而改造的基因工程抗体，再连接放射性核素、毒性分子或制备重组蛋白等细胞毒性物质，则完全有可能准确地以肿瘤组织血管新生过程表达的一些特征性分子为靶、破坏其血管内皮细胞并形成血栓，从而断绝其营养通道并最终导致肿癌细胞的死亡。果真如此的话，制备出能全方位选择性识别肿瘤组织血管内皮细胞的新型多克隆抗体，定将为肿瘤的生物导向治疗开辟出新的更有效的途径。