[发明专利]通过扩增编码酮泛解酸盐还原酶的核苷酸序列制备泛酸的方法

权利要求书

1.通过扩增，特别是过量表达编码酮泛解酸盐还原酶的核苷酸序列，特别是panE基因，单独地或彼此结合地，和任选地还扩增，特别是过量表达ilvC基因，制备和改善产生泛酸的微生物的方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于为了获得过量的表达，通过插入携带这些基因或核苷酸序列的质粒载体来增加微生物中基因或核苷酸序列的拷贝数。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于为了获得过量的表达，将结构基因上游的启动子和调节区域进行突变。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于为了获得过量的表达，将表达盒掺入到结构基因的上游。

5.根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于在具有一个或多个代谢物和/或抗代谢物抗性突变的微生物中扩增，特别是过量表达编码酮泛解酸盐还原酶的核苷酸序列。

6.根据权利要求2-5所述的方法，其特征在于为了获得扩增或过量表达，改变培养基和/或发酵程序。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于在微生物中去除降低了泛酸盐(泛酸)的形成的代谢途径。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于去除了avtA基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于去除了ilvE基因。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在微生物中，特别是在棒状杆菌属或大肠杆菌中过量表达或扩增谷氨酸棒状杆菌的ilvC基因。

11.根据权利要求1-9所述的方法，其特征在于除了编码酮泛解酸盐还原酶的核苷酸序列之外，扩增，特别是过量表达了一个或多个泛酸形成的代谢途径的基因。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于还扩增、尤其是过量表达一个或多个编码酶酮泛解酸盐羟基甲基转移酶(EC4.1.2.12)，天冬氨酸1-脱羧基酶(EC4.1.1.11)和泛酸盐合成酶(EC6.3.2.1)的基因。

13.根据权利要求11和12所述的方法，其特征在于使用了含有所述基因的各种相容质粒载体。

14.根据权利要求10和11所述的方法，其特征在于使用了用彼此相容的一个或多个质粒载体转化的菌株，该质粒载体携带一个或多个所述基因，包括panE基因，可以将所述基因置于公用的启动子的控制下，连续地排列，或在各种启动子的控制下彼此独立地排列。

15.质粒载体pFE80，其特征在于附图6再现的限制性图谱寄存于大肠杆菌K12MG1655/pFE80，保藏号为DSM12414。

16.质粒载体pFE65，其特征在于附图5再现的限制性图谱寄存于大肠杆菌K12MG1655/pFE65，保藏号为DSM12382。

17.质粒载体pFE32，其特征在于附图4再现的限制性图谱寄存于大肠杆菌K12MG1655/pFE32，保藏号为DSM12413。

18.大肠杆菌K12菌株FE6，它携带缬氨酸抗性。

19.大肠杆菌K12菌株FE7，其中以avtA∷aadB片段交换avtA基因，该菌株保藏号为DSM12380。

20.大肠杆菌或棒状杆菌属的微生物(宿主细胞)，它含有权利要求11-14所述的质粒载体之一并且任选地含有一个或多个代谢物和/或抗代谢物抗性。

21.谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032/pFE91，它含有具有谷氨酸棒状杆菌的ilvC基因的质粒载体pFE91。

22.制备泛酸的方法，其特征在于实施了下面的步骤：

a)将前面一项或多项权利要求所述的微生物发酵，

b)将培养基或微生物细胞中的泛酸浓缩，

c)分离泛酸。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于加入酮泛解酸盐作为前体。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于在步骤a)中加入选自β-丙氨酸或酮异戊酸的泛酸的前体。

25.根据前面一项或多项权利要求所述的方法，其特征在于使用了大肠杆菌或棒状杆菌或酵母属的微生物。