[发明专利]一种新的多肽－DBH和PAM20和编码这种多肽的多核苷酸

说明书

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——DBH和PAM20，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。

铜在哺乳动物中作辅因子是较为罕见的，仅发生在五种已知的酶中：单加氧酶[DBH，肽基-甘氨酸α-酰胺酶及酪氨酸酶]，胺氧化物酶，超氧化物歧化酶，细胞色素氧化酶以及血浆铜蓝蛋白。尽管铜的出现十分有限，但由含铜酶催化的反应对于生物体内环境稳定至为重要。Ⅱ型铜，抗坏血酸依赖的单加氧酶是需要铜作辅因子，用抗坏血酸作为一种电子供体的一类酶，现已发现两个成员：1)多巴胺-β-单加氧酶(DBH)，催化多巴胺转化为神经递质去甲肾上腺素。DBH在肾上腺髓质的分泌儿茶酚胺的小泡(嗜铬颗粒)及交感神经系统的大的致密核心接合泡中催化多巴胺转化为神经递质及激素去甲肾上腺素。在肾上腺嗜铬颗粒中，已知DBH以可溶及膜结合蛋白形式均能存在，且二者之间的酶活分布几乎相等。经嗜铬细胞刺激，颗粒细胞膜与质膜融合，并释放其可溶的内含物，其中包括多巴胺-β-单加氧酶的可溶形式。该酶的膜结合形式自细胞表面被胞吞，并通过在颗粒膜中重新填入分泌蛋白的高尔基区域循环重新形成嗜铬颗粒。来自嗜铬颗粒的可溶性DBH的刺激偶联分泌归因于功能意义尚未知晓的原生质中的酶。由多巴胺-β-单加氧酶催化的反应要求双氧及外源电子供体(体内抗坏血酸)，并把DBH置于酶的单加氧酶家族中。多巴胺-β-单加氧酶是极少几种需要抗坏血酸作辅因子的被良好特征标记的酶。与儿茶酚胺生物合成途径中的两种含有蝶呤的单价氧化物酶(苯丙氨酸羟化酶及酪氨酸羟化酶)不同，多巴胺-β-单加氧酶仅含有铜作为辅因子。2)肽基-甘氨酸α-酰胺单加氧酶(PAM)，催化许多活性肽及激素的羧基端甘氨酸转化为酰胺基，并伴随有分泌作用，且对有些激素原的全部生物潜能极为重要。

DBH及PAM的相似性有如下几点：二者都是含有Ⅱ型铜的单加氧酶，来自分泌颗粒，都需要抗坏血酸及分子氧。抗坏血酸在二者的作用中都通过线粒体的半脱氢抗坏血酸还原酶及细胞色素b561再循环。它们有相同的动态机理，都能使用儿茶酚或亚铁氰化物作为单电子还原剂。最重要的是二者具有相同的催化区域。多巴胺-β-单加氧酶(DBH)及肽基-甘氨酸α-酰胺单加氧酶(PAM)两者之间有一些区域序列相似，其中的两个区域含有保守的组氨酸残基簇：H-H-M-x(2)-F-x-C及H-x-F-x(4)-H-T-H-x(2)-G，它们可能与结合铜有关，我们选择这两个区域作为信号模式。DBH及PAM的催化活性形式中每个亚基含有两个被还原的铜，每一个Cu²⁺有3-4个组氨酰咪唑的配位层，Cu-S与DBH或PAM的被还原的Cu⁺形式配位，以H-H-M-x(2)-F-x-C模板中的甲硫氨酸邻近序列作为配体。

综上所述，DBH及PAM有相似的生化性质及相似的结构，因而两者被归为同一家族：Ⅱ型铜，抗坏血酸依赖的单加氧酶家族。

由于如上所述DBH和PAM20蛋白在机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的DBH和PAM20蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新DBH和PAM20蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。

本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——DBH和PAM20以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供含有编码DBH和PAM20的多核苷酸的重组载体。

本发明的另一个目的是提供含有编码DBH和PAM20的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供生产DBH和PAM20的方法。

本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——DBH和PAM20的抗体。本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——DBH和PAM20的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。本发明的另一个目的是提供诊断治疗与DBH和PAM20异常相关的疾病的方法。本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；