[发明专利]一种高效提取活化的凝血因子X(FXa)的方法

说明书

本发明是关于利用牛血作原料、高效提取活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的问题，属于生物技术领域。

凝血因子Ⅹ(FX)是一个糖蛋白(约含糖10％)，它是维生素K依赖的凝血因子，在凝血的瀑布反应中，位于内外源通路的交汇点，所以对凝血的过程有着重要的影响。凝血因子Ⅹ在血浆中的含量一般认为有10毫克/升左右。当血液中的凝血瀑布反应被启动后，凝血因子Ⅹ可以被正常地活化。对外源通路来说，活化剂是活化的凝血因子Ⅶ和组织因子的复合物，在Ca²⁺存在条件下进行。对内源通路来说，活化剂是活化的凝血因子Ⅸ。活化的凝血因子Ⅷ作为辅酶，大大加速了后者的反应。这一反应不可缺少的条件仍然有Ca²⁺，另外还有磷脂的存在。而非正常的活化凝血因子Ⅹ不需要凝血因子蛋白的参与，是否有磷脂存在也不要求，只要求有Ca²⁺存在即可。世界各地的蝰蛇毒素普遍含有非正常活化凝血因子Ⅹ的特异水解酶，蝰蛇毒素中的这种特异水解酶已被用于活化的凝血因子Ⅹ(FXa)的制备中。另外某些肿瘤细胞也含有这类特异水解酶。1985年在肿瘤研究中，发现恶性肿瘤细胞在血液迁移中也能非正常地活化凝血因子Ⅹ，也许正是FXa的定域作用，所以使肿瘤细胞表面产生了纤维蛋白，而这一凝血层象保护壳一样，防御了天然杀手的进入，同时也可躲避免疫系统的识别，这也许是肿瘤跨组织迁移得以实现的一种方式。

抗凝血和抗血栓的新型药物一直是新药研究的重点。专一有效地抑制FXa比抑制凝血酶的效果更好。这是因为凝血酶在血液的抗凝系统中也有重要的作用，而FXa则不介入血液的抗凝系统。专一有效的抑制FXa可以使药效大大的提高。同时，专一有效的抑制FXa还可能具有抗肿瘤迁移的作用。这些研究都需要FXa，特别是现代药物设计所需要的蛋白晶体结构，也将需要较大量的FXa。

由于FXa是选择性很高的精氨酸肽键水解酶，近来已被基因工程的科学家设计成融合基因表达的融合蛋白的限定性内切酶(或称特异性水解酶)，如瑞典Pharmacia公司开发的GST融合基因载体，pGEX系列所设计的活化的凝血因子Ⅹ标识序列为Ile Glu Gly Arg↓，与其它的限定性内切酶相比，它的优点是可以保持克隆后的目的蛋白的全部氨基酸序列，能完全避免不希望引入的氨基酸对产品分子结构的干扰。这种内切酶可以将融合蛋白中目的蛋白按照设计者的意愿，从融合蛋白中设计的酶切位点上切割下来，从而达到了高纯高效的分离目的。在现代的基因工程中，融合蛋白已经扮演了重要的角色，它的高效表达的特性，不仅日益受到重视，特别是它具有纯化“标签”的性质，在亲合色谱中得到了充分的应用，在检测上也是带来诸多便利。限定性内切酶在融合蛋白分离中可以结合分离手段而巧妙的应用，不仅大大简化了分离步骤，提高目的蛋白回收率，而且纯度一般优于直接表达目的蛋白的产品。而药物融合蛋白的生产则是活化的凝血因子十应用的一个新热点。

因此，高效制备FXa是非常有意义的。

目前国内尚无这类分离研究的报道，在国际上现行的文献报道中，都是以研究为目的的分离方法，速度慢，难以满足科技发展的需要。例如，Radcliffe等人利用牛血前处理得到的含凝血因子Ⅹ的步骤较多，再利用DEAE-Cellulose柱层析两次分离方法，再透析除去小分子量杂质，分离时间较长，且FXa容易失活。

本发明的目的就是利用现代分离手段，通过减少分离步骤，提高分离效率，从牛血中获得高纯度活化的凝血因子Ⅹ(FXa)，以达到广泛应用的目的。本发明的实行方案：(1)含凝血因子Ⅹ的牛血粗提物的获得：取牛血14升，向每升牛血中加入100毫升抗凝剂(含0.2mol/L柠檬酸三钠，17000unit/L肝素，0.2mol/L苯甲脒，10000unit/L大豆胰蛋白酶抑制剂)，立即离心，得到亮黄色血浆；向每升血浆中滴加100毫升1mol/L氯化钡溶液，得到吸附凝血因子Ⅹ的柠檬酸钡沉淀；将沉淀加入到30％饱和度的硫酸铵溶液，搅拌3小时，离心后取清液，再使清液硫酸铵饱和度达到65％，静置约5小时，离心后取含凝血因子Ⅹ的蛋白沉淀，溶解，透析，冷冻干燥，即得含凝血因子Ⅹ的牛血粗提物，以备后用。(2)凝血因子Ⅹ纯化：Q-Sepharose柱液相层析