[发明专利]人α2b型干扰素的基因合成、表达质粒构建及产物的制法

说明书

本发明涉及一种用基因工程技术实现大量生产人α2b型干扰素的方法

人α2b型干扰素作为重要的生物高科技产品，是治疗乙肝、丙肝等病毒性疾病和恶性肿瘤的重要药物。在我国，干扰素的生产工艺复杂，产量偏低，成本较高，还不能为广大工薪阶层广泛接受和使用，影响了干扰素的产业化进程，因此大幅度降低其生产成本是当前干扰素开发中的一项重要任务。

人α2b型干扰素当前存在生产成本高的问题，其主要原因是：表达水平偏低，干扰素蛋白的表达只占菌体可溶性蛋白的1-2％；干扰素成品的获得需经历多重复杂的纯化工艺流程，纯化损失大，回收率只有10-20％。

对本发明通过全基因分段合成和PCR拼接，构建了全人工合成的人α2b型干扰素基因，利用原核表达载体pBV220和pWT7在大肠杆菌DH5α中以包涵体形式获得高效表达，并建立了一整套简便有效的纯化人α2b型干扰素的工艺流程，提高了干扰素的表达量和最终得率。人α2b型干扰素的表达量达到菌体可溶性蛋白的20％，干扰素α2b的最终产量可提高数十倍，大幅度降低了干扰素制剂的成本。全人工合成高产廉价人α2b型干扰素的研制成功，将带来干扰素产业的更新换代，具有巨大的社会效益和经济效益，造福广大人民。

以下对本发明进行详细描述。1．人α2b型干扰素基因DNA序列的设计

通常的技术改进手段，如上游表达载体的优化、下游工程中表达与纯化工艺的改良等，对干扰素的表达量与最终得率的提高的效果均不明显。本发明从影响异源蛋白在大肠杆菌中表达水平的另一重要影响因素---基因的密码子构成入手，对人α2b型干扰素基因进行了全面的设计与合成。

同一种氨基酸乃至蛋白质多肽分子，根据密码子的简并性，可由不同的DNA序列来编码。不同生物种对蛋白质的编码基因的密码子的喜好性是不同的，现有的人α2b型干扰素基因的DNA序列是自正常人白细胞经新城疫病毒诱导后克隆而来，其密码子构成体现了人对编码蛋白质的密码子喜好性，将这种DNA序列通过载体由大肠杆菌来表达，因此得到很低的表达水平。采用大肠杆菌的喜好密码子来替代天然密码子，是提高干扰素的可行手段。

本发明根据各种密码子的在大肠杆菌中的使用频率，保留人α2b型干扰素的氨基酸序列不变，选用在大肠杆菌的喜用密码子，取代原有人α2b型干扰素基因DNA序列中的非喜用密码子，设计全新的人α2b型干扰素基因DNA序列。人α2b型干扰素的氨基酸序列、天然基因及合成基因的序列见附图k2．人α2b型干扰素基因的全人工合成

根据所设计的DNA序列，采用全基因分段合成和PCR拼接的策略，构建人工合成的人α2b型干扰素基因。2．1 在通用的DNA自动合成仪上采用亚磷酸酰胺法化学合成以下7段长度为90bp左右的DNA片段，编号分别为L1,L2,L3,R1,R2,R3和R4。其中L1的5‘端含EcoR1位点，R4的3’端含BamH1位点，以便向表达载体插入。

序列中的阴影部分，表示该处是两段DNA片段互补搭接之处。2．．2利用PCR反应体系，搭桥法分步延长合成的IFNα2b基因片段。2．2．1 DNA片段L3,R4的链延长反应

根据设计，L3与R4的末端有20个碱基互补，这使两链相连，在PCR反应体系中，两链未互补部分互为模版发生链延长。反应条件：L3 5μL(0.10D/μL),R45μL(0.10D/μL),10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)16μL,H₂O 63μL，反应体系共100μL。94℃恒温5min，55℃恒温加入TaKaRa LATaq酶1μL后，恒温5min,72℃,5min.即可得到由L3和R4拼接而成的两条互补长链，名为L3R4，为下一步PCR反应的模版。2．2．2 DNA片段L2,R3的链延长反应

与前一步同理，依据设计，L2与L3有20bp的互补序列，R3与R4有20bp的互补序列。利用引物L2和R3进行如下的PCR反应，反应条件：L2(0.01 OD/μL)1pL,R3(0.01 0D/μL)1μL,模板L3R4 1μL,10×TaKaRa La buffer10μL,dNTP(25mmol/L)10μL,TaKaRa LA Taq酶1μL,H20 76μL，反应体系共100μL,94℃,30s,55℃30s,72℃,30s，共30循环。产物名为L2L3R4R3，为下一步PCR反应的模版。2．2．3 DNA片段L1,R2和R1的链延长反应