[发明专利]马传染性贫血病毒代表毒株的全基因克隆及其应用

说明书

本发明涉及马传染性贫血病毒的一种强毒株(本文称为辽系野毒株或LN)和一种经过多次马属动物细胞传代得到的减毒疫苗株(本文称为驴胎皮肤细胞适应株或FD)的全长前病毒DNA序列、各功能基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列及各功能基因及蛋白产物的应用。所述的两种毒株是我国自行分离得到的。

马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus,EIAV)是引起马传染性贫血的病原体，是最早被人类发现的病毒。马传染性贫血于1843年首先在法国发现，一个多世纪以来对畜牧业造成了巨大的危害，因而也是各国科学家一直在致力研究和控制的疾病之一。我国自六十年代起投入巨资对该病毒的生物学性状进行了研究，分离并培育出与国外毒株有明显差异的强毒株进行体外驴白细胞传代，逐步驯化该病毒使之成为无致病力，但可以使动物在接种之后产生较坚强免疫保护的疫苗株，该疫苗株自1976年开始生产，1978年在全国大规模应用，至今已接种7000万匹马骡驴，已经控制了该病在我国的流行(沈荣显等，马传染性贫血免疫的研究。中国农业科学，第4期P1-15,1979)。

EIAV属逆转录病毒科慢病毒属(lentivirus)，与同属于慢病毒属的人类免疫缺陷病毒(Human Immunodificiency Virus,HIV)在基因组结构，基因编码蛋白及基因调控方式等方面有许多相似之处(J.M.Coffin,The structure And Classfication of Retroviruses,The Retroviridae,Vol.1,p19,edit by Jay A.Levy,Plenum Press),EIAV的逆转录酶、蛋白酶、dUTP酶、包膜糖蛋白和核心蛋白的结构和功能与HIV的相应组份亦有很高的相似性，而且马传染性贫血病毒感染马属动物后引起急性发病的马症状特点为周期性发热、红血球减少性贫血和持续性病毒血症，易于观察和研究，因此该病毒成为研究慢病毒感染和致病机制及病毒酶功能的重要模型(R.C.Montelaro et,al Equine Retroviruses,in:vol.2,p257)。

对EIAV病毒基因组的研究是在70年代分子生物学技术发展并得到广泛应用之后才兴起的。现在GenBank中已发表的马传染性贫血病毒的全长基因组序列均来源于美国标准强毒株(Wyoming株)和日本强毒株(Goshun株)，及由它们衍生得到的细胞培养适应株的基因序列。我国的马传染性贫血病毒原始强毒株(辽系野毒株)是我国自行分离的有代表性的流行毒株，经过在驴白细胞和驴皮肤细胞中连续多次传代分别获得了驴白细胞适应株和皮肤细胞适应的疫苗株，这些毒株的获得为我国成功地研制马传染性贫血疫苗并最终控制该病在我国的流行起决定性作用。但是由于我国的马传染性贫血病毒辽系野毒株、驴白细胞适应株和皮肤细胞适应的疫苗株的均采用经典病毒学的路线进行培养和研究，它们的全长基因序列尚未被阐明，因而无法从基因水平上对我国EIAV疫苗的母体毒株进行有效的保护。另外，对病毒基因组的一级结构的研究又是进一步研究各功能基因的高级结构和功能的基础，因此辽系野毒株和皮肤细胞适应株全长基因序列的发明对研究该病毒的感染和致病的分子机制，揭示该病毒在细胞培养传代过程中毒力自然致弱的分子机理可提供直接有力的证据。另外，由于辽系野毒株为EIAV白细胞弱毒疫苗株的母体毒株，其基因序列的阐明将为寻找EIAV毒力基因及比较研究强弱毒株之间在基因水平的差异提供最重要的基础。

因此，本发明的第一个目的在于提供马传染性贫血病毒的一种强毒株(辽系野毒株LN)的全长前病毒DNA序列、各功能基因的序列及其编码蛋白的氨基酸序列，及其应用。

本发明的第二个目的在于提供经过多次马属动物细胞传代得到的减毒疫苗株(驴胎皮肤细胞适应株FD)的全长前病毒DNA序列、各功能基因的序列及其编码蛋白的氨基酸序列，及其应用。