[实用新型]微量荧光细胞计数板

说明书

本实用新型属于细胞生物学荧光检测技术领域，是一种微量荧光细胞计数板。

荧光细胞计数是荧光方法中的一项基本技术。荧光方法具有灵敏度高、特异性强、方法简便的特点。该方法可用于研究细胞及细胞内各化学成分的分布、定位、吸收、转运。当前应用于荧光细胞计数的仪器主要有两种，即流式细胞仪和荧光显微镜。流式细胞仪的检测精确度只有1％左右，在某些检测工作中难以满足要求，而且仪器设备价格昂贵，技术复杂，难以普及；至于荧光显微镜，它必须结合一定的观察视野和容量才能进行计数：其中一种做法是在载玻涂片上随机选择任一视野进行检测计数，由于该法受视野的大小和选择次数的限制，受检的样品量受到很大的限制。一般在4X物镜下，每视野的受检样品量不超过1μl，因而可重复性差，对微量荧光细胞计数无统计学意义。如果进行连续检测计数，则因载玻涂片没有一定的刻度来定位细胞涂片的深度和视野坐标，而导致细胞堆积重叠和漏检及重检，难以满足微量荧光细胞计数工作的需要。另一种做法是结合应用常规的血细胞计数板进行计数，该法又由于每次检测的样品量仅为0.9μ1，而难以满足微量荧光细胞计数工作的需要。

本实用新型的目的在于提供一种结合荧光显微镜的应用，既可人工操作又可微机处理、技术简单、价格低廉、检出率高的微量荧光细胞计数板。

本微量荧光细胞计数板是对常规血细胞计数板的改进，其板面如图1所示。

图1为计数板俯视结构示意图：包括计数板板身1、计数池2、导液凹槽3。计数板板身1，与现有血细胞计数板相同，长度为74mm，宽度为33mm，厚度为10mm；计数池2位于计数板中央，其长宽各20mm，以刻度线纵横平均等分80×80格，共计6400个正方形小格，其深度为0.1mm；盖玻片也相应扩大，其长度约40mm，宽度约25mm，厚度约3mm；该计数板一次检测样品量可达40μl，是常规的血细胞计数板或随机视野检测容量的40多倍，增加了检测样品量，提高了微量荧光细胞检出率(最低可达1/105阳性率)；导液凹槽3位于计数池的两侧，长度与计数板板身1的宽度相同，槽宽约3mm、深为板厚度的1/2-2/3约6mm。

本微量荧光细胞计数板检测方法与常规的血细胞计数板计数类似，但有以下几点注意事项：

①上样：取待检样品约100μl，滴于计数池的一端，并在该端盖上盖玻片，顺势赶出气泡并放下另一端，使样品充盈整个计数池，静置2分钟后便可检测；

②计数样品细胞总数：用常规的血细胞计数板计数细胞总数，即包括荧光阳性和阴性细胞数；

③将荧光显微镜目镜作适当的技术处理：由于一般的目镜其视野为圆形，而计数池为正方形，为便于计数，可以用锡箔纸等薄片剪成外圆内方的屏蔽，嵌衬于目镜镜筒中，使视野变为方形，与计数池的方格线相吻合。一般使用4X物镜和10X目下，可将一直径为13mm的圆形锡箔纸中央剪出一个15mm×4mm的矩形方框嵌衬于目镜镜筒中，这样在一个视野中便可纵向观察和检测14格(排)了；

④计数方法：在荧光视野下，由于荧光细胞数少而且清晰可见，可以快速水平横向连续移动计数池，上下不重叠连续纵向移动以换行，共换6行(次)便可计数完毕(6行×14排)；

⑤按需要可重复检测2-3次，计算阳性荧光细胞率。例如：以红色荧光PKH-26标记的CD34⁺造血干细胞10⁴个通过静脉输入到一个受体小鼠体内(该小鼠骨髓细胞总数一般为10⁸个)，3天后杀死小鼠取两条股骨的骨髓细胞，先以常规的血细胞计数板计数一定量的骨髓细胞数，然后离心浓缩至每80-100μl细胞悬液含10⁸个细胞，再以本微量荧光细胞计数板在荧光显微镜下重复检测2-3次，用来计数红色荧光细胞数(约1×10²-2×10²个)，则阳性细胞率为1×10^-5～5×10^-4，由此可计算出CD34⁺造血干细胞的归巢率(10％-20％)。在这种情况下若用流式细胞仪和常规的血细胞计数板，是不能完成此项计数工作的。

⑥为了节省工作量，也可以结合高分辨摄像或数码照像，通过电脑分析计数，则过程更为简单和精确。

优点和积极效果：

本微量荧光细胞计数板使用简单方便，一次检测样品量可达40μl，大大提高了检出率，最低可达1/10⁵。本实用新型既可用于检测各种生物活性荧光细胞，也可以用于检测非荧光标记的微量细胞(如，精子细胞等)。