[发明专利]检测活组织中幽门螺杆菌的组合物、试剂盒和方法

说明书

发明背景

(a)发明领域

本发明涉及引起肠胃失调的细菌源幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(下面称之为H.pylori)的检测，特别涉及一种将铵离子定量测定的酚盐方法用于常规脲酶的酶试验而产生的检测幽门螺杆菌用的组合物，和涉及使用该组合物的检测试剂盒和方法。

(b)相关技术的描述

幽门螺杆菌是已知的一种引起包括胃癌和胃十二指肠溃疡的肠胃失调的细菌源，WHO已将幽门螺杆菌定为典型的致癌原。幽门螺杆菌的精确诊断，即准确检测，应当有助于治愈这种幽门螺杆菌引起的肠胃失调。迄今为止所使用的幽门螺杆菌检测方法可以主要分为两种类型，即不使用内窥镜的非侵袭性测试和使用内窥镜得到检测用活检组织的侵袭性测试。

非侵袭性测试包括血清学测试和¹³C或¹⁴C呼吸测试。测定幽门螺杆菌抗体的血清学测试的问题在于抗体的存在不一定就表示疾病的发展，因为疾病治愈后抗体水平的降低要6个月以上。¹³C或¹⁴C呼吸测试应用的原理是当摄食由¹³C或¹⁴C标记的脲时，如果幽门螺杆菌存在的话，则其转化为胃中标记的CO₂，并且在呼出的空气中检测到。但是，该方法不经常使用，因为其涉及昂贵的仪器。

另一方面，比较通常使用的是侵袭性测试来检测幽门螺杆菌。使用内窥镜内窥期间采集的活检组织样品的侵袭性测试的检测方法包括：组织学方法、PCR(聚合酶链反应)方法、培养法和脲酶测试。组织学是通过一般的组织检测证实幽门螺杆菌存在的方法；PCR方法是通过使用聚合酶链反应证实幽门螺杆菌存在的方法；培养法是直接培养来自活检组织的幽门螺杆菌的方法。但是，问题在于所有这些方法都较困难而且耗费大量时间，所以不能商业化应用。

脲酶的酶测试是容易在内窥镜室中使用的而且是最有效的方法，这是因为幽门螺杆菌产生的脲酶与其它微生物相比具有高得多的活性。也就是说，如果脲酶存在，则检测试剂盒中加入的脲被分解，并且产生的氨引起pH增加，使pH指示剂反应和变色。幽门螺杆菌检测方法就是测定脲酶的这一活性大小。目前使用脲酶酶测试的商售试剂盒是“CLOtest”(USPNo.4748113)，“Hpfast”(USP No.5439801)，和“Pyloritek”(USP No.5314804和5420016)。“CLOtest”中使用的组合物含有10-40g/l脲、1-5g/l杀细菌剂、有效量的pKa6.5-8.5指示剂(酚红)和余量的是水，pH为5.0-6.5。但是CLOtest的问题在于因为上述组合物和幽门螺杆菌产生的脲酶的反应速度慢，所以阳性比例随着各个读数者变化。因此，只有在大约24小时之后才可能诊断，并且在内窥镜检查日不能得到诊断结果，这很不方便，需要患者再次到医院。此外，多于24个小时之后，出现各种颜色使得精确诊断困难。Hpfast在原理上类似于CLOtest，但是不同之处在于加入了细胞壁去污剂并且用酚红、甲基红、和溴麝香草酚蓝的混合物作为指示剂。使用Hpfast，从pH6.2的深绿色测得幽门螺杆菌阳性和pH6.0的浅绿色测得幽门螺杆菌阴性。但是，深绿色和浅绿色的精确读数困难。Pyloritek使用了多层试验装置，不同于上面提到的CLOtest和Hpfast，其主要特征在于脲酶进行反应的部分和反应产物作为氨检测的部分是在不同的层上，并且各层的pH是不同的。尽管Pyloritek可以在一个小时内产生诊断结果，但是如果测定时间超过一小时，则假阳性比例增大。因此，如果在内窥镜检查期间不遵守精确的时间，则假阳性的可能性增加。

此外，上面提到的包括CLOtest和Pyloritek等的脲酶酶方法还能与例如人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、唾液球链菌(Streptococcus salivarius)、产气假杆菌(E.aerofacienes)、发酵乳细菌(L.fermentum)等这些杆菌所具有的少量低活性的脲酶发生反应，并且在长的鉴定时间情况下假阳性比例会增大。

发明概述

本发明的目的是要解决上面提到的常规技术中的问题，通过提供幽门螺杆菌检测组合物、幽门螺杆菌试剂盒、和使用上述组合物快速和精确测定是否存在引起肠胃失调细菌源的幽门螺杆菌感染的方法。本发明还提供在一定时间过后的相同试验结果，并且其可以容易地在内窥镜室中使用。