[发明专利]编码具有合成噢哢类活性的蛋白质的基因

说明书

所属技术领域

本发明是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因及其应用的发明。更详细地说，本发明是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的多酚氧化酶的基因及其应用的发明。再详细点说，本发明例如是有关编码具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的来自于金鱼草的蛋白质的基因及其应用的发明。

背景技术

花的颜色中，橙、红、紫和青主要是由称之花青甙的类黄酮产生的。黄色大多是由所谓类胡萝卜素、ベタレイン的类黄酮以外的化合物产生的，但一部分植物的黄色是由类黄酮产生的。例如金鱼草、深波叶补血草、牵牛花、大丽花、蜡菊、菊芋、大波斯菊一部分品种中的花瓣中存在着属于噢哢类的化合物(齐藤、バイオホルテイ1、49-57、1990)。

作为噢哢类已知有4’，6-二羟基-噢哢、4，4’，6-三羟基-噢哢、金鱼草素、硫磺菊素、蜡菊噢哢等，金鱼草中含有金鱼草素和蜡菊噢哢、深波叶补血草中含有金鱼草素、牵牛花中含有金鱼草素、大丽花含有硫磺菊素、蜡菊含有蜡菊噢哢、菊芋含有硫磺菊素。

另外已知在菊科的金鸡菊(コレオプシス)属、向日葵属、肿柄菊(テイトニア)属、ジニア属、ビ ギユエラ属，杜鹃科的ゥアツキニゥム属，莎草科的莎草属，豆科的アカシア属、紫檀(プテロカルプス)属、soja属，茜草科的コンロンカ属的一部分也有噢哢类化合物存在于植物体中(类黄酮(The flavonoids)，J.B，Harbone编，1988，Chapman &Hall，340-342)。

虽然花青素甙的生物合成途径正在深入地研究，而有关噢哢的生物合成，从其结构看出4’，6-二羟基-噢哢可由2’，4，4’-三羟基查耳酮合成的，关于它的反应也有报道说与过氧化物酶有关(Rathmel和Bendall，生物化学杂志(Biochem.J)127，125-132，1972)，但使用植物花瓣的提取液等明确测定噢哢的生物合成反应的例子还没有，阐明植物花瓣中发生了什么样的反应的报告也没有。另外纯化参与噢哢合成的酶的报告也没有。

发明的公开

在此本发明人试图阐明噢哢的生物合成系统，提供控制植物、特别是植物花色的手段。

本发明人建立了使用含噢哢类的金鱼草花瓣的粗提取液测定由查耳酮类合成噢哢类反应的分析方法。此时生成的噢哢类并不是以前人们认为的4’，6-二羟基-噢哢，而是金鱼草素，此次可测定的反应是到目前为止人们还不知道的反应。另外使用本分析方法从金鱼草的花瓣可以将以查耳酮类为底物合成噢哢(金鱼草素)的酶(金鱼草素合成酶)纯化至电泳上单一一条带。使用该纯化的酶样品弄清了该酶的生物化学性质。也确定了该酶的部分氨基酸序列。根据该氨基酸序列从来自金鱼草花瓣的cDNA文库得到了以查耳酮类为底物合成噢哢的噢哢合成酶的基因。

作为查耳酮类已知有四羟基查耳酮、五羟基查耳酮、紫铆因、2’，4，4’-三羟基查耳酮等。

另外得到的基因在作为多酚氧化酶活性中心的铜的结合区域具有同源性。因此就已知的一种多酚氧化酶-酪氨酸酶是否具有由查耳酮合成噢哢活性进行确认时，明确了酪氨酸酶也具有合成噢哢活性。

因此本发明提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的蛋白质的基因。进一步是提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的多酚氧化酶的基因。再进一步是提供编码具有以查耳酮为底物合成噢哢活性的氨基酸序列如序列2所示的蛋白质的基因。另外本发明还提供含有上述基因的载体。

另外本发明还提供经上述载体转化的宿主。该宿主既可以是微生物、植物细胞、动物细胞等细胞，也可以是植物体。

本发明还提供以培养上述细胞，或栽培上述植物为特征的噢哢合成酶、例如金鱼草素合成酶的生成方法。生成的酶可以提取，还可以为了调节植物体内的颜色的色调使其发挥功能。这种情况下通过植物体内生成的酶合成噢哢类，该噢哢类可以调节植物体、例如花的颜色。

因此本发明也提供植物花色的调节方法，其特征是将具有以查耳酮类为底物合成噢哢类活性的酶基因，例如金鱼草素合成酶基因导入植物或植物细胞，使该基因表达，通过生成的酶在植物体内合成噢哢类。另外本发明也提供象上述那样花色被调节的植物。

另外本发明还提供噢哢类的合成方法，其特征是使上述的酶蛋白质作用于作为底物色素的查耳酮类化合物。

本发明还提供上述基因编码的酶蛋白质。

附图的简单说明

图1表示噢哢类和查耳酮类化合物的结构式。

图2表示噢哢生物合成的路线。