[发明专利]通过基因治疗自行调控炎性细胞的凋亡

权利要求书

1．一种嵌合核酸分子，其包含：

至少一个连接至TNFα启动子上的TNFα启动子增强子区，该增强子区包含核酸SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或其保守性取代或等位基因变体；

该TNFα启动子进一步连接至编码粒酶B蛋白的核酸序列或其保守性取代或等位基因变体上，所述核酸序列又进一步连接至3′UTR核酸序列上。

2．权利要求1的嵌合核酸分子，其中存在二至五个TNFα启动子增强子区，且其中任一增强子区包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：12或其组合。

3．权利要求2的嵌合核酸分子，其中该TNFα启动子包含核酸SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或其保守性取代或等位基因变体。

4．权利要求1的嵌合核酸分子，其中该核酸分子序列是选自SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14及其保守性取代或等位基因变体。

5．权利要求1的嵌合核酸分子，其中该3′UTR是连接于粒酶B核酸序列的下游。

6．一种药物组合物，其包含权利要求1的嵌合核酸分子。

7．一种治疗炎性病症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求6的药物组合物给药于需要这类治疗的患者。

8．权利要求7的方法，其中该炎性病症是选自类风湿性关节炎、多发性硬化、急性热病性多神经炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、牛皮癣、移植物排斥宿主病、红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、牛皮癣性关节炎、结节病、过敏性肺炎、关节强硬性脊椎炎、Reiter’s综合征及全身性硬化。

9．权利要求8的方法，其中所述炎性病症是类风湿性关节炎。

10．一种构建嵌合核酸分子的方法，该嵌合核酸分子含有至少一个TNFα启动子的增强子，该增强子连接至最小TNFα启动子的功能性拷贝上，该功能性拷贝进一步连接至功能性凋亡-诱导核酸分子的至少一个拷贝上，该功能性凋亡-诱导核酸分子的拷贝进一步连接至TNFα-3′UTR核酸序列上，其中所述凋亡-诱导核酸的表达受TNFα启动子所驱动，该方法包含：

(a)用包含TNFα启动子缺失构建体的引物经聚合酶链式反应扩增含TNFα启动子的核酸分子；

(b)将步骤(a)中得到的经PCR扩增的核酸克隆至报道核酸序列的上游，以产生一种构建体；

(c)在至少一种产生TNFα的细胞系中检测步骤(b)中所得的构建体的组成型表达和诱导型表达；

(d)在该细胞系中筛选决定着报道基因的诱导型表达的TNFα启动子；

(e)对增强报道基因表达的TNFα启动子区进行PCR-扩增，以获得增强子，并将至少一拷贝增强子连接于该启动子上游；

(f)通过用凋亡-诱导核酸缺失构建体置换该报道基因，而将至少一拷贝凋亡-诱导核酸分子插入TNFα启动子的下游；及

(g)对TNF α-3′UTR进行PCR扩增，并将其连接于凋亡-诱导核酸分子的下游，以获得所述嵌合核酸分子。

11．权利要求10的方法，其中将二或多拷贝的增强子插入所述启动子的上游。

12．权利要求10的方法，其中报道核酸序列为萤光素酶。

13．权利要求10的方法，其中所述增强子包含选自SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的序列。

14．权利要求13的方法，其中所述凋亡-诱导核酸为粒酶B或其保守性取代或等位基因变体。

15．权利要求10的方法，其产生选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、及其保守性取代或等位基因变体的嵌合核酸分子。    

16．权利要求10的方法，其中用于检验构建体的细胞是选自T类淋巴母细胞、骨髓单核细胞、单核细胞、成纤维细胞、经培养的人滑膜细胞及存在于RA中的初级细胞。