[发明专利]核酸片段、含有该片段的重组载体以及应用该片段启动结构基因表达的方法

说明书

本发明涉及具有启动位于其下游的结构基因表达之功能的核酸片段、含有该片段的重组载体以及用该片段启动结构基因表达的方法。

对外源基因表达的启动是将基因工程应用到植物中的最迫切需要的技术。这一技术包括对具有启动基因表达之活性的DNA片段的应用。启动外源基因表达的已知DNA片段包括玉米醇脱氢酶的内含子(Callis等，基因和发育1,1183-1200(1987))、水稻磷脂酶D的第一内含子(后文亦称之为“PLD”)(国际公开号WO96/30510)。此外，通过缺失内含子内部区域的一部分或通过在该内含子内部位点插入同样的内含子而对启动基因表达之活性所造成的影响，已有文献报道(Mascarenhas等，植物分子生物学，15,913-920(1990),Clancy等，植物科学，98,151-161(1994))。

然而，到目前为止，可应用于该目的的DNA片段的数目十分有限，而且在大多数情况下，它们启动基因表达的效应也不够强。因此需要具有较高活性的DNA片段。此外，尽管有人尝试通过修饰内含子序列而增强启动表达之活性，但至今尚未有关于内含子中具有启动表达的活性之区域的报道，内含子来源的初始DNA片段的启动活性加倍的情况也属未知。

因此，本发明的一个目的是提供新型核酸片段，该片段具有较高的启动位于其下游的结构基因的表达的活性；包含上述核酸片段的重组载体，其中结构基因的表达被启动；还提供了用上述核酸片段启动位于其下游的结构基因表达的方法。

本发明人通过深入研究发现，水稻磷脂酶D(下文也称“PLD”)的第一内含子中特定区域具有较高的启动基因表达的活性，据此完成本发明。

即，本发明提供了具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的分离的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸的分离的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，所述片段具有启动其下游结构基因表达之活性。本发明还提供了重组载体，其至少包含具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)，和位于所述核酸片段下游、其表达由所述核酸片段启动的结构基因。本发明还提供了启动结构基因表达的方法，包括在所述结构基因上游的位置处插入具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段(排除具有序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸)。本发明还提供了一种植物，其中目的结构基因的表达由本发明的方法启动，以及保持这种特性的该植物的子代。

通过本发明，提供了通过在结构基因上游的位点处插入核酸而显著启动结构基因表达的新核酸片段。通过在结构基因上游的位点处插入本发明的核酸片段可启动结构基因的表达。因此，通过本发明，可启动如重组载体中外源基因的表达，从而预期本发明将对基因工程或相关领域作出较大贡献。

如上所述，本发明的核酸片段是具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸片段或具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同但其中已取代或缺失一或多个核苷酸、或已插入或添加一或多个核苷酸、并具有启动位于所述核酸片段下游的结构基因表达之活性的核酸片段。但序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列是水稻PLD中第一内含子的核苷酸序列，因本发明人曾公开：水稻PLD的第一内含子具有启动位于其下游的基因表达的活性(国际公开号WO96/30510)，故将该序列排除在外。SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是水稻PLD的第一内含子(SEQ ID NO:3)中从5’-端第二个核苷酸(后文称为“2nt”)至65nt的区域核苷酸序列。