[发明专利]pH特性改变的卤过氧化物酶

说明书

发明领域

本发明涉及与野生型相比最适pH改变的卤过氧化物酶(haloperoxidase)变体。

发明背景

卤过氧化物酶构成了这样一类酶，它们能在有过氧化氢的情况下根据下式将卤化物(X=Cl^-、Br^-、或I^-)氧化为相应的次卤酸(HOX)：    

如果存在一个方便的亲核受体，它会和HOX发生反应从而可能形成各种卤化反应产物。

氯化物过氧化物酶(chloride peroxidase，EC1．11．1．10)是一种能消耗H₂O₂，氧化氯、溴以及碘离子的酶。

溴化物过氧化物酶(bromide peroxidase)是一种能消耗H₂O₂，氧化溴和碘离子的酶。

碘化物过氧化物酶(iodide peroxidase，EC1．11．1．8)是一种能消耗H₂O₂，氧化碘离子的酶。

钒卤过氧化物酶与其他卤过氧化物酶不同之处在于前者的辅基结构特点与钒酸盐(钒V)类似，而后者是血红素过氧化物酶。

已经从多种生物中分离到了卤过氧化物酶：哺乳动物、海洋动物、植物、藻类、地衣、真菌以及细菌(参考生物化学与生物物理学报1161，1993：249-256)。普遍接受的看法是卤过氧化物酶是造成自然界中形成卤化化合物的酶，虽然其他酶可能也参与这一过程。

来自真菌不等弯孢的含钒氯过氧化物酶(chloroperoxidase)的氨基酸序列(SEQ NO．1)已有公开(见SWISS-PROT：P49053)。

来自真菌Curvularia verruculosa的含钒的氯过氧化物酶的氨基酸序列(SEQ NO．2)已有公开(见WO9704102)。

来自真菌不等弯孢的含钒的氯过氧化物酶其X-射线结构已有公开(美国科学院学报93(1)，1996，392-396；以及pdblvnc．ent)。

目前对卤过氧化物酶的兴趣是由于其广泛的潜在工业用途。例如，已有建议将卤过氧化物酶作为一种抗微生物试剂。

发明简述

本发明涉及含钒的卤过氧化物酶变体，其最适pH相对亲本卤过氧化物酶有所改变，因此具体来说，本发明涉及：

亲本含钒卤过氧化物酶的变体，该变体具有卤过氧化物酶活性，最适pH改变并在与至少下列位点之一对应的位置包含突变：

R490A，L，I，Q，M，E，D；

A399G；

F397N，Y，E，Q；

P395A，S；

R360A，L，I，Q，M，E，D；

K353Q，M；

S402A，T，V，S；

D292L；

A501S；

W350F，Y；

V495A，T，V，S；

K394 A，L，I，Q，M，E，D；

其中所述亲本卤过氧化物酶含有SEQ ID NO：1给出的氨基酸序列，或者该亲本卤过氧化物酶含有的氨基酸序列与SEQ ID NO：1至少80％同源。发明详述同源的含钒卤过氧化物酶

由不同真菌产生的许多含钒卤过氧化物酶在氨基酸水平上是同源的。

将不等弯孢与C．verruculosa的卤过氧化物酶进行比对。比对使用得自不等弯孢3D结构图的卤过氧化物酶氨基酸序列(Brookhavendatabank file pdblvnc．ent)。

利用由UWGCG程序得到的同源性百分比(该程序使用了采用系统设定参数的GAP程序：罚分：间隙度(gap weight)=3．0，长度(1engthweight)=0．1；WISCONSIN PACKAGE version8．1-UNIX，1995年8月，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)，发现了以下同源性：

包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的不等弯孢含钒卤过氧化物酶：100％；包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的C．verruculosa的含钒卤过氧化物酶：96％。