[发明专利]用PCR检测目标核酸的方法

权利要求书

1．一种用于检测样品中是否存在目标核酸序列的方法，该方法包括(a)使用一套核苷酸对所说的样品进行扩增反应，其中至少一个核苷酸是被荧光标记的，(b)在探针与所说的目标序列杂交的条件下使扩增产物与探针接触混合，所用的探针包括一种活性分子，该活性分子能够从荧光标记核苷酸吸收荧光或向其贡献荧光能量及(c)检测样品的荧光。

2．根据权利要求1的方法，其中活性分子从荧光标记核苷酸上吸收荧光。

3．根据权利要求2的方法，其中活性分子是一种在特征波长下发射能量的接受体分子。

4．根据权利要求3的方法，其中接受体分子是罗丹明染料或其它染料如Cy5。

5．根据前述任何一项权利要求的方法，其中标记的核苷酸是标记的尿嘧啶。

6．根据前述任何一项权利要求的方法，其中所有用于扩增反应中的核苷酸都是标记的。

7．根据前述任何一项权利要求的方法，其中扩增反应包含多聚酶链式反应(PCR)。

8．根据前述任何一项权利要求的方法，其中标记核苷酸与活性分子两者的荧光都被监测并且计算发射光间的关系。

9．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针在整个扩增反应中都存在。

10．根据权利要求9的方法，其中荧光信号被监测，其结果用于定量样品中存在的目标序列的数量。

11．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针设计为可以被在扩增反应中所用的DNA多聚酶水解。

12．根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中探针设计为在扩增反应的延伸阶段从目标序列上完整地释放出来。

13．根据权利要求12的方法，其中扩增反应用一种缺乏5’-3’外切酶活性的酶实现。

14．根据权利要求13的方法，其中该酶为Taq酶的stoffle片段或Pwo。

15．根据权利要求12-15的任何一项的方法，其中探针3’末端通过磷酸化封闭。

16．一种用于检测核酸扩增的方法，包括：在下述条件存在下，对目标多核苷酸进行核酸扩增，(a)一种核酸多聚酶，(b)至少一条能够与所说的目标多核苷酸杂交的引物，(c)一套核苷酸，至少其中之一为荧光标记，(d)一种能够与目标多聚核苷酸序列杂交并且含有一种能够从标记的核苷酸吸收荧光能量或供给其荧光能量的活性分子的寡聚核苷酸探针；以及监测扩增反应期间的荧光变化。

17．根据权利要求16的方法，其中扩增通过用一对引物完成，引物被设计为仅仅一条DNA链内的目标核苷酸序列被扩增。

18．根据前述任何一项权利要求的方法，其中探针对或者RNA的一个剪接区域或者在DNA中的一个内含子是特异的，以使扩增的RNA或扩增的DNA中仅有一种被检测和/或定量。

19．用于确定序列的特征的方法，该方法包括(a)用至少其中一种为荧光标记的一套核苷酸扩增所说的序列，(b)在探针与所说靶序列杂交的条件下接触混合扩增产物与探针，所说的探针包含一种能够从荧光标记的核苷酸吸收荧光或向其供给荧光能量的活性分子并且(c)监测所述样品的荧光及测定作为所说序列特征的特定反应条件，在该条件下由于探针与该样品杂交或在探针与目标核酸序列间形成的双链体不稳定而导致荧光变化。

20．用于检测一种多态性和/或等位基因变异的方法，该方法包括用如权利要求1限定的方法扩增怀疑含有所说多态性或变异的序列，用产生的荧光信号测量探针从扩增产物上解链的温度，将这一测量结果与一种多态性或等位基因变异的存在相关联。

21．用于前述权利要求中任一项的方法的试剂盒，它包含一种对含有一种活性分子及一种与该活性分子相匹配的荧光标记核苷酸的目的核苷酸序列特异性的探针。