[发明专利]编码参与淀粉合成的小麦酶的核酸分子

说明书

本发明涉及编码参与植物体内淀粉合成的小麦酶的核酸分子。这种酶为一种异淀粉酶。

本发明还涉及含有本发明中的核酸分子的载体、宿主细胞以及植物细胞和植物。

另外，本发明描述了生产转基因植物的方法，由于导入了本发明的核酸分子，这种转基因植物合成特征发生变化的淀粉。

鉴于近来将植物成分作为可更新原料的重要性越来越大，作为生物技术研究的主题之一，正努力使植物原料适应加工工业的要求。为了在尽可能多的应用领域使用可更新原料，必需产生多种多样的材料。

除了油、脂肪和蛋白质外，多糖也是植物的重要可更新原料。多糖中占主要地位的除了纤维素外就是淀粉，它是高等植物体内最重要的储存物质。在此，小麦是最重要的农作物之一，因为欧共体的淀粉产量中大约20％是从小麦获取的。

多糖淀粉是化学上相同的基本结构单元-葡萄糖分子-的聚合物。但是这里，涉及的是由不同分子形式组成的很复杂的混合物，这些分子在聚合度、葡萄糖链的支化及其链长方面不同，此外还可能衍生化，例如磷酰化。因此，淀粉不能构成均一的原料。人们特别区别了直链淀粉，一种由α-1,4-葡萄糖苷键连接的葡萄糖分子形成的基本上无支化的聚合物，与支链淀粉，它是由不同支化的葡萄糖链的复杂的混合物构成。这里，支化是通过发生附加的α-1,6-葡萄糖苷键连接而产生的。小麦中合成的淀粉含有约11-37％的直链淀粉。

为了将合适的淀粉尽可能多样性地应用于不同的工业需求，希望提供这样的植物，其能够合成特别适于不同应用目的的改性淀粉。提供这种植物的一种可能性是植物育种措施。但由于小麦是多倍体性状(四倍体和六倍体)，已证明植物育种很难施加影响。最近才通过自然出现的突变体的杂交生产了“蜡态”(无直链淀粉)的小麦(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995),253-259)。

替代植物育种方法，可通过重组方法实现生淀粉植物的特异性改变。但是对此，前提是识别和表征参与淀粉合成和/或淀粉改性的酶以及分离编码这些酶的核酸分子。

导致淀粉合成的生化途径基本上是已知的。植物细胞中淀粉的合成在质体中进行。在光合成活性的组织中，这些质体是叶绿体，在无光合成活性的组织中淀粉储存组织是造粉体。

借助重组方法实现植物体内合成淀粉支化度的进一步控制改变，仍然要求识别编码参与淀粉代谢、特别是淀粉分子内引入和降解支化的酶的DNA序列。

除了在淀粉分子中引入支化的所谓Q-酶以外，在植物酶中还有能够解除支化的酶。这些酶称为脱支酶，根据其底物特异性分为三组：a)支链淀粉酶，它们除了普鲁兰外，还利用支链淀粉作为底物，出现在微生物如克雷伯氏杆菌属和植物体中。植物体中这些酶也称为R-酶。b)异淀粉酶，它不利用普鲁兰，而是利用糖原和支链淀粉作为底物，同样出现在微生物和植物体中。例如，异淀粉酶已在玉米(Manners ＆ Carbohydr.Res.9(1969),107)和马铃薯(Ishizaki等，Agric.Biol.Chem.47(1983),771-779)中报道过。c)淀粉-1,6-葡萄糖苷酶，据报道存在于哺乳动物和酵母体内，利用临界糊精作底物。

Li等证明，在甜菜中除了5种内淀粉酶和2种外淀粉酶以外，只有一种支链淀粉菌酶型的脱支酶(Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。该酶的大小为约100kD，最适pH值是5.5，位于叶绿体中。据报道菠菜中也含有脱支酶，它利用普鲁兰作底物。菠菜和甜菜中的脱支酶在与支链淀粉底物反应时的活性都比与普鲁兰底物反应时的活性小5倍(Ludwig等，Plant Physiol.74(1984),856-861;Li等，Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。

在农业中重要的储存淀粉的农作物－马铃薯方面，Hobson等研究了脱支酶的活性(J.Chem.Soc.,(1951),1451)。成功地证明，与Q-酶不同，该酶不具有链增长活性，而只是水解α-1,6-葡萄糖苷键。但是这种酶至今还未能准确加以表征。就马铃薯来说，已经提出了脱支酶的提纯方法以及提纯蛋白质的部分肽序列(WO95/04826)。在此期间报道了菠菜中脱支酶的提纯以及相应的cDNA的分离(Renz等，Plant Physiol.108(1995),1342)。