[发明专利]重组马铃薯Y病毒组构建物及其应用

说明书

本发明总体上涉及适用于提供抗植物中病毒感染的保护作用的重组马铃薯Y病毒组感染性核酸构建物，并且涉及含有所述构建物的重组病毒。更具体地说，本发明涉及含有HC-Pro基因(它的编码保守FRNK盒的序列包含一个替代)的重组马铃薯Y病毒组感染性构建物。优选地，精氨酸(Arg)被异亮氨酸(Ile)替代。

本发明进一步涉及利用上述构建物生产马铃薯Y病毒组的温性株(mild strain)的方法，并且涉及应用所述构建物保护植物以防病毒感染和在植物中瞬时表达外源核酸(基因)的方法。优选地，本发明涉及一种抗ZYMV感染的葫芦科植物(curcurbits)交叉保护方法。

葫芦科是一个大的植物科，它包括数个经济上重要的全世界栽培的品种，例如黄瓜、南瓜、罗马甜瓜、夏南瓜(zucchini pumpkin)、甜瓜和西瓜。全世界的葫芦科植物生产受数种蚜虫传播的病毒的影响，最流行的是两种马铃薯Y病毒组ZYMV(夏南瓜黄色花叶病毒)和WMV-2(西瓜花叶病毒2)和CMV(黄瓜花叶病毒)。ZYMV感染的植物显示这样的症状：例如，叶脉消除，接着，受感染的系统叶(systemic leaf)上出现黄色花叶病，而且可能表现出枯萎和变形。在轻微感染的情况下，产品的产量和质量都受影响，在严重感染时，可能完全损失，引起显著的经济损失。

控制措施包括：植物检疫、彩色塑料覆盖物(引诱携带病毒的蚜虫)的应用和在植物周围产生疏水性屏障(例如喷油)。这些措施在大量感染时提供暂时的保护和有限的保护。

或者通过传统育种或者通过植物的遗传工程将得自病毒的核酸序列引入植物基因组来开发病毒抗性栽培品种也被用于保护植物以抗病毒感染。生产了呈现对ZYMV的抗性的南瓜杂交转基因近交系[TricoliD.M.,Carney K.J.,Russell McMaster  P.F.,Groff D.W.,HaddenK.C.,Himmel P.T.,Hubbard J.P.,Boeshore M.L.和 QuemadaH.D.(1995)生物工程(Biotechnology),vol.13:1458],但这些只限于一个栽培品种。

交叉保护的现象(它是应用病毒的温性株来保护以抗由同一病毒的恶性株感染引起的损伤)提供了一种良好的控制病毒病的方法。

在葫芦科植物中，交叉保护(尤其抗ZYMV)是一种吸引人的控制选择。交叉保护在恶性病压力下是高度有效的。由葫芦科植物上ZYMV引起的病严重性和葫芦科植物的短植物生长周期(8～16周)使交叉保护成为葫芦科植物的一种优选的控制选择。

目前使用的用于葫芦科植物交叉保护的ZYMV的温性株是由Lecoq获得的[Lecoq H.,Lemaire JM.,Wipf-Scheible C.,(1991)Plant Dis.75:208～211]。该株被称为“ZYMV-WK”，很少被蚜虫传播，只引起轻微的叶斑，而且不会导致葫芦科植物中的果实畸形。通常通过机械接种在早期用温性株(ZYMV-WK)接种植物。

不存在该温性病毒的全长感染性克隆。

马铃薯Y病毒组具有一个由正义单链RNA构成的基因组，该RNA具有共价键连接的5＇末端病毒蛋白(Vpg)和3＇末端poly(A)尾。该病毒RNA作为单一的聚蛋白被表达，它接着通过三种病毒编码的蛋白酶被加工，产生八到十个基因，它们是整个马铃薯Y病毒组基因组的保守区。马铃薯Y病毒组通过蚜虫以非持久性方式从植物传播到植物，并且该过程依赖于两种病毒编码的蛋白质的存在，即外壳蛋白(CP)和辅助组分蛋白酶HC-Pro。HC-Pro是一种在蚜虫传播、聚蛋白加工、病毒复制、症状表达和病毒在植物内的运动中涉及的多功能蛋白质[MaiaI.G.,Haenni A.和Bernardi F.,(1996)普通病毒学杂志(Journal ofGeneral Virology)77:1335～1341]。

夏南瓜黄色花叶病毒(ZYMV)是马铃薯Y病毒组的一员，它在全世界大批生产的葫芦科植物中引起破坏性的流行病。构建了ZYMV的全长克隆(从它产生了感染性转录物)[Gal On A.,Antignus Y.,Rosner A.和Raccah B.(1991)普通病毒学杂志72:2639～2643]。