[发明专利]通过同源重组修饰FSHβ基因的表达

说明书

                     发明领域本发明涉及基因组DNA。

                      发明背景

目前用治疗蛋白治疗疾病的方法包括给予在体外生产的蛋白和基因治疗。体外生产蛋白一般包括将编码目的蛋白的外源DNA引入到培养的合适的宿主细胞中。在另一方面，基因疗法包括给予患者包含目的治疗蛋白编码序列的基因工程细胞、质粒或病毒。

也可以用基因导向技术，以所需的方式通过改变某些治疗蛋白的内源基因的表达来生产所述治疗蛋白。参阅例如美国专利第5,641,670号、5,733,761号和5,272,071号；WO 91/06666、WO 91/06667和WO 90/11354，所有这些都通过引用整体结合到本文中。

                      发明概述

本发明是基于对人促卵泡激素β(“FSHβ”)基因的编码序列的5′基因组DNA的鉴定和测序。此DNA例如可以用于DNA构成物，当将该构成物通过同源重组整合到哺乳动物细胞的基因组时，所述构成物改变(例如增加)内源FSHβ基因在该细胞中的表达。“内源FSHβ基因”意指编码FSHβ的基因的基因组(即染色体)拷贝。所述构成物包含导向序列和转录调节序列，所述导向序列包括或来自于最近公开的5′非编码序列。所述转录调节序列最好在序列上与内源FSHβ基因的转录调节序列不同。所述导向序列引导所述调节序列整合到靶基因的FSHβ编码序列之中或其上游的区中，以使该调节序列可操作地连接至所述内源编码序列。所述“可操作地连接”是指所述调节序列可以指导内源FSHβ编码序列的表达。所述构成物还可以包含易于选择已稳定整合所述构成物的细胞的选择性标记基因和/或另一个可操作地连接至启动子的编码序列。

在一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)导向序列，(b)调节序列，(c)外显子，和(d)剪接供体位点。所述导向序列引导其本身和元件(b)-(d)整合到靶基因的FSHβ编码序列之中或其上游的区中。一旦整合，元件(b)则可以指导元件(c)和(d)以及所述内源基因的所有下游编码序列的转录。在所述构成物中，所述外显子通常位于所述调节序列的3′，而所述剪接供体位点位于所述外显子的3′末端。

在另一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)导向序列，(b)调节序列，(c)外显子，(d)剪接供体位点，(e)内含子，和(f)剪接受体位点，其中所述导向序列引导其本身和元件(b)-(f)整合，以使元件(b)-(f)处于所述内源基因之中或其上游。然后所述调节序列指导产生转录本，所述转录本不仅包括元件(c)-(f)，而且包括所述内源FSHβ编码序列。最好使所述内含子和所述剪接受体位点位于所述剪接供体位点的下游构成物中。

所述导向序列与在要发生同源重组的基因组中预先选择的靶位点同源。它包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的至少20(例如至少30、50、100或1000)个连续的核苷酸，所述SEQ ID NO：4对应于人FSHβ基因组序列的核苷酸-7454至-1417(相对于翻译起始位点编号)，所述SEQ ID NO：5对应于人FSHβ基因组序列的核苷酸-696至-155。所谓“同源”是指所述导向序列与其基因组靶位点相同或足够相似，以使所述导向序列和靶位点可以在人细胞中进行同源重组。只要同源重组可以以有效频率发生，那么小百分率的碱基对错配可以接受。为了易于同源重组，所述导向序列最好为至少约20(例如至少50、100、250、400或1000)个碱基对(“bp”)长。所述导向序列也可以包括SEQ ID NO：4或5所包含区以外的基因组序列，只要其包括这两个区之一中的至少20个核苷酸。例如，可以由位于SEQ ID NO：4和FSHβ基因的转录起始序列之间的序列衍生另外的导向序列。

由于可能存在于FSHβ基因的基因座上的多态性，在任何给定的哺乳动物物种中任何给定的基因组靶位点的核苷酸组分都可以发生微小改变。对应于SEQ ID NO：4或5的这种多态变异体(尤其是人多态变异体)的导向序列属于本发明的范围。