[发明专利]葡萄球菌属的趋化性抑制蛋白(CHIPS)及其应用

说明书

本发明涉及一种可用于治疗炎症反应的新蛋白质。本发明进一步涉及一种纯化所述蛋白质的方法。最后，本发明涉及一个筛选试验，应用该筛选试验可检测类似蛋白质。

炎症反应是一种很普遍的过程，其中，防御细胞奔向一个感染源并在此处保证消灭病原。在这里释放不同的介体，它们有助于消灭作用但还产生炎症。可以区别急性炎症(例如脓毒)和潜伏的慢性炎症(例如风湿症)。抵抗力降低了的人更经常而且更严重地出现急性炎症(例如在艾滋病的情况下)。

细菌感染导致趋化因子的形成，趋化因子保证白细胞来到感染源。趋化物质以梯度形式存在，白细胞沿着该梯度定向运动。趋化剂的来源可能是细菌自身。这些趋化剂例如是具有末端甲酰基的小蛋白质，例如fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸)。其它趋化剂有：活化补体因子(过敏毒素C3a和C5a)，白三烯[例如LTB4(白三烯B4)和PAF(血小板活化因子)，以及由不同类别的细胞产生的趋化因子，例如白细胞介素-8(单核细胞和内皮细胞)，RANTES(活化时调节的、正常T-细胞表达和分泌的)，eotaxin,MCP(单核细胞趋化蛋白)，MIP(巨噬细胞炎性蛋白)和其它趋化因子。

某些趋化因子仅仅对确定类别的白细胞是特异性的，其它的则影响很多细胞。趋化因子的受体被细分为两大类：CC受体和CXC受体，它们都属于蛇根碱(跨膜7次的受体)。蛇根碱是视紫红质样的GTP结合蛋白连接的受体。

趋化细胞因子的总科(趋化因子)的特征在于4个保守半胱氨酸。根据前两个半胱氨酸的相对位置可区别两科：CXC或α-趋化因子与CC或β-趋化因子。CXC趋化因子尤其对粒细胞有活性，而CC趋化因子则活化宽范围的白细胞(包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、T-淋巴细胞、NK细胞和树枝状细胞)。该科趋化因子和典型性趋化剂(例如fMLP和C5a)结合并活化蛇根碱。

趋化因子的中和已在实验上被应用了，具体地说，发现了施用抗IL-8的抗体在一些动物实验炎症模型中有效。此外，最近证实了一些趋化因子受体(尤其CCR5和CXCR4)在HIV感染细胞中起辅因子的作用。就HIV的T细胞营养株来说，CXCR4已被鉴定为辅因子，就单主寄生株来说，这是CCR5。用抗体或配体封阻这些受体抑制了体外模型中的HIV感染。此外，发现了具有CCR5受体的遗传性变型(包括32个碱基对缺失)的人们能抗HIV感染。

除了趋化性的诱导、白细胞的定向迁移之外，低浓度的一些趋化因子也是其它白细胞功能的有效激活剂或引物。所以，希望实现趋化因子的封阻，于是，可以抑制炎症反应。

因此，本发明的目的是提高一种具有炎症-抑制特性、用于治疗急性和慢性炎症反应和HIV的新治疗剂。

在导致本发明的研究过程中，在生长的金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(S.aueus)]胞外培养基中发现了一种蛋白质，发现该蛋白质能封阻不同的趋化因子受体。将不同的细胞与培养基保温导致一些趋化因子受体的表达[既包括典型性趋化剂(例如fMLP和C5a)的受体在粒细胞上的表达又包括CXCR4和CCR5受体在淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞上的表达]大为减少。受体表达的减少与趋化性相对于趋化因子的大为降低有关，也与HIV的感染减小有关。

在生长的金黄色葡萄球菌培养物上清液中表现了该蛋白质的活性。然而，按本发明，还通过一些配体染料柱纯化了所述活性蛋白质。首先在所谓的“黄色柱”[“活性黄86”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma)]上进行了预纯化，接着在吸附层析柱[所谓的“绿色柱”(“活性绿19”配体染料交联的4％珠状琼脂糖柱(Sigma))]和DNA柱[DNA纤维素(Pharmacia)]上进行。后两种柱可以互换。所述DNA柱除去与本发明的蛋白质相同分子量的污染物。所述吸附层析柱浓缩蛋白质并且对该蛋白质是选择性的。最后，还通过凝胶过滤和任选浓缩的方法进行了后纯化。在凝胶过滤中，选定了分子量约为17kD的蛋白质。这就是本发明的蛋白质。

所述纯化方法的每一步都可通过检测不同柱的流过物质或洗出液的活性来监测。这是通过监测流过物质或洗出液是否能防止fMLP与粒细胞结合而进行的。实施例中给出了详尽的试验方案。

通过微量测序测定了纯化了的蛋白质的前(N-末端)15个氨基酸。在图4中给出了该序列。序列分析表明，未发现与数据库中已知细菌的或真核生物的氨基酸序列的同源性。所以，这是一种新的、独特的蛋白质。