[发明专利]无细胞嵌合体制备技术和异源双螺旋突变载体的真核应用

说明书

1．发明领域

嵌合体制备技术(chimeraplasty)涉及通过将双螺旋寡核苷酸导入靶细胞来在DNA的特定位点导入定向改变，这种方法通过细胞同源重组和错误修复系统进行加工，使靶DNA序列在有差别的位置转变为寡核苷酸的序列。本发明涉及在无细胞系统中实施的嵌合体制备技术方法。

2．发明背景

2.1嵌合体制备技术

在E.B.Kmiec(简称“Kmiec”)的美国专利5565350(1996年10月15日公告)和5731181(1998年3月24日公告)中公开了真核细胞中的嵌合体制备技术和所用的双螺旋重组诱发性寡核苷酸。由Kmiec公开的重组诱发性寡核苷酸含有彼此杂交的核糖型核苷酸如2’-O-甲基-核糖核苷酸和脱氧核糖型核苷酸，它们被称为嵌合突变载体(CMV)。在Yoon,K等1996年《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)93:2071中报道了经设计用于修复编码肝/骨/肾型碱性磷酸酶的基因中的突变的CMV。碱性磷酸酶通过质粒被瞬时导入CHO细胞。6小时后，导入CMV。在导入CMV24小时后回收质粒并进行分析。结果表明约30％至38％的碱性磷酸酶基因被CMV修复。

在Cole-Strauss,A等1996年《科学》(Science)273:1386中描述了经设计用于矫正引起镰刀细胞病的人β珠蛋白基因中的突变的CMV以及其成功的应用。在Kren等1998年，《天然药物》(NatureMedicine)4:285-290中公开了经设计用于在大鼠肝细胞的大鼠血凝集因子Ⅸ基因中产生突变的CMV。在Kren等1997年7月的《肝病学》(Hepatology)25:1462中给出了一个CMV例子，该CMV的第一条链含有一个与第二条链的非互补碱基配对的碱基。

1996年5月1日由E.B.Kmiec,A Cole-Strauss和K.Yoon申请的、以WO97/41141于1996年11月6日公开的美国专利申请系列08/640517以及1997年8月5日申请的申请系列08/906265公开了用于治疗造血细胞的遗传病如镰刀细胞病、地中海贫血和家族性脾性贫血的方法和CMV。

在Kren等1997年7月的《肝病学》(Hepatology)25:1462中给出了一个CMV的应用实例，该CMV的第一条链含有一个与第二条链的非互补碱基配对的碱基。在Kren的CMV中，含有所需的、不同的序列的链是含有2’-O-甲基核糖核苷酸的链，该链与具有3’末端和5’末端的链配对。美国专利5565350描述了含有2’-O-甲基化RNA的单个片段的CMV，该片段位于具有5’末端核苷酸的链上。

申请人知道包含了有关嵌合突变载体的教导的下列在前申请：Steer等1997年4月30申请的60/045288；1997年8月5日申请的60/054837；1997年11月10申请的60/064996；和由Steer&Roy-Chowdhury等于1998年2月12日申请的60/074497，题目为“通过改变APO B和APO E基因的预防和治疗方法”。

2.2无细胞重组

已公开了利用无细胞提取物进行同源重组的各种报道。

Hotta,Y等1985年《染色体》(Chromosoma)93:140-151报道了用酵母、小鼠精母细胞和Lilium的抽提物影响两个突变pBR322质粒间的同源重组。其中一个质粒是超卷曲的，第二个质粒可以是线性的或者超卷曲的。最大重组率不到1％。在Kucherlapati,R.S.等1985年《分子和细胞生物学》(Molecular and Cellular Biology)5:714-720中报道了用突变体缺陷型pSV2neo和EJ细胞提取物进行的类似的试验。最大重组率为约0.2％。Kucherlapati报道绝对需要一个线性化的突变质粒。相反在Hotta的报道中，尽管环状和线性质粒间的重组率更高，但还报道了两个环状质粒间的重组。

Jessbrger,R.,&Berg,P.,1991年《分子和细胞生物学》(Mol.&Cell.Biol.)11:445的报道涉及通过核提取物催化的质粒间的重组。它在两个方面与上述两种情况不同。报道的重组率为约20％，与不到0.5％的重组率形成对比。另外，Jessberger观察到环状质粒间的重组率与环状与线性质粒间的重组率相同。