[发明专利]一种在棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄分生组织区选择转基因细胞的方法

说明书

发明领域

本发明涉及应用biolistic方法导入外源基因，该外源基因与一个能够移位并选择棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植株转基因分生组织细胞的分子有关，并通过再生转化组织而获得转基因植株。

发明背景

应用基因工程技术导入感兴趣的农业性状的负责基因，有利于开发新的各种栽培作物。要获得转基因植物，需要采用把外源DNA导入植物组织，并从这种遗传转化的组织中再生整株植物的方法。依据要被转化的物种，各种组织已经被用来导入外源DNA。在多种转化方法中，分生组织被优选采用，主要由于该组织易于再生植株。已经提出许多把外源基因导入高等植物顶端分生组织细胞的方法，其中可提出以下方法：a)biolistic系统和b)土壤杆菌系统。外源DNA在高等植物细胞的导入及整合已经被许多科学家证明，并在不同的刊物上有所描述，例如(McCabe D.Martinelli B.J.(1993)通过粒子轰击分生组织转化优良的棉花栽培品种。生物/技术11:596-598；KellerG.,Spatoa L.,McCabe D.,Martinelli B.,SWain W.,JohnM.E.(1997)转基因棉花抵抗除草剂双丙氨酰膦，转基因研究，6:385-392)。

然而，由于遗传转化组织获得的频率低，该转化组织再生可育植株的能力低，加上使用了效率依赖于基因型的转化方法，所有这些使大多数栽培作物很难获得转基因植株。

80年代末，随着把基因直接导入植物细胞的biolistic方法的发展(Sanford J.C.,Klein T.M.,Wolf E.D. & Allen N.(1987)，用粒子轰击的方法将物质运送到细胞组织；粒子科学及技术杂志，5:27-37)，若干种植物，包括那些被证明用其它方法很难转化的种类，都已获得了大量转基因植株。这是由于在任何种类的植物组织导入并表达外源基因都已经成为可能。这样，任何一种有再生完整可育植株潜能的组织都适用于转化。

biolistic方法是由Sanford提出来的，目的是把遗传物质导入高等植物核基因组。从那以后，它的广泛应用已经得到肯定。并且根据Sanford J C，Smith F D & Russel J.A.(1993)的观察结果：优化用于不同生物应用中的biolistic方法；酶学方法：217:413-510。已经证明它是一种有效而简单的方法，用于在细菌、原生动物、真菌、海藻、昆虫、植物和动物组织以及分离细胞器，象叶绿体和线粒体中导入并表达基因。在专业文献中有一些其它的应用biolistic方法获得转基因生物有机体的例子，例如，美国专利5,565,346，美国5,489,520和WO 96/04392，以及其它。

在biolistic方法中，运用高速的显微发射物携带并转导核酸及其它物质进入活体内的细胞和组织。(Rech E.L.&Arago F.J.L.(1997)biolistic方法。在Brasileiro A.C.M. & Cameiro V.T.C(Ed)的植物遗传转化手册-EMBRAPA/Cenargen中。该方法也被称作显微发射物轰击法，“基因枪”法，粒子加速法以及其它。已经发展并建立了不同的方法，能够把被有核酸序列的微粒(由钨或金制成)加速到1500km/h以上。所有这些方法的基础都在于产生一个带有足够能量的冲击波，以排出一种运输膜，该运输膜包含着包被DNA的微粒。可以通过化学爆炸(干火药)，高压放射氦气，高压低容或低压高容放电汽化水滴这些方法产生该冲击波。

那些使用高压氦气和放电的方法已经表现了广泛的应用范围。加速粒子以非致死的方式穿透细胞壁和膜，随机定位于细胞器。然后DNA通过细胞液的运动而从微粒上游离下来，并发生了把外源DNA整合到要改变的有机体的基因组的过程。(Yamashita T.Iada,A.& Morikawa H.(1991)-证明了90％以上表达b-葡糖醛酸糖苷酶的细胞在粒子轰击后都直接把外源基因接受到细胞核；植物生理97:829-831)。尽管biolistic方法已有效而广泛地应用，它仍依赖于多种物理和生物参数的最优化，这些参数是把异种基因有效导入植物组织的基础。