[发明专利]使用多孔硅将物质转入细胞

说明书

本发明涉及将物质转入细胞的方式以及微针阵列。

经常会有许多时候需要将物质转入细胞，例如出于基因操作的目的，常需要将核酸或核酸的构建物如载体或质粒转入细胞。此外，化学制品也需要转入细胞，如核苷酸或染料以及影响细胞生理的化学制品。现在已经开发出相当数量的化学及机械的方法将物质转入细胞内，这些技术包括：

1．直接注射：将针插入细胞，物质通过针被推入细胞；

2．电穿孔法：细胞膜通过高压电击使之变得对某些分子具有通透性；

3．生物弹射：钨或金粒子被待转移的物质所覆盖然后被打入细胞；

4．磷酸钙共沉淀法：细胞可以吸收磷酸钙沉淀，因此若将DNA/其他物质与磷酸钙共沉淀便可将其转入细胞；

5．介导转化(通过脂质体，病毒或细菌载体)；

6．原生质体转化。

本发明的一方面的目的是使用一种新材料来辅助将物质转移进入细胞。

本发明的另一方面的目的是提供一种改进的方法，以提供小体积的物质。

直接微注射包括将含有DNA的微针直接插入单个细胞的细胞核。一个玻璃微吸液器与一个微操作器相连，将10-8-10-7微升的物质通常是DNA片段溶液注入细胞核。只要有足够的操作熟练程度，“击中率”是确定的，但这项技术很繁琐，不能应用于大量细胞。

基于第一个方面所说，本发明包含将物质转入细胞的方法。

优选地可吸收或可被生物吞噬的多孔硅将被使用。

在一个实施方案中，包含最少一个区域(region)的多孔硅的微针被使用，或者，这样的微针阵列被使用。

基于第二方面所说，本发明包括含多孔硅的微针或微针阵列。

基于第三方面，本发明包括将物质转移进入细胞的工具，这个工具至少部分包括多孔硅以及将要转入细胞的物质。

优选多孔硅是可吸收的。这种工具可以包括多孔硅生物弹射子弹。这种工具包含可与被转移入细胞的物质共沉淀的物质。这种工具可以包括一个可导电的有生物活性的多孔硅电极。

基于本发明的第四个方面，本发明包括使用多孔硅作为转运物质进入细胞的工具。

现在发现多孔硅是生物相容的，并且多孔硅能侵入或被吸收入哺乳动物细胞，没有明显的有害效应。多孔硅可用于定位和固定化某些生物活性物质(或将转入细胞的物质)，这些物质一旦进入细胞就可以与细胞DNA结合，或者释放入细胞产生效应。

从PCT专利申请WO 96/10630可知有一种微型机器化的硅刺(barbs)或尖头(tips)的阵列来用于同时机械刺穿大量细胞的浆膜。这比用单针刺单个细胞有效的多，后者如需向上百个细胞导入物质将是一项非常工作量巨大的工作。事后看来，WO 96/10630的尖头转移物质的效率很低。例如，在那份文件中设想的是利用紧密排列的尖头之间的表面张力来装载即将被转入细胞的物质，将它限制于尖头(探针)与底物之间。

1993年公开的US5 262 128中讨论了一个建议，并声称可以教本领域的技术人员使用Liga法生产硅针。据信这个文件在提交(及公开时)仍不可实施，因此对本发明的新颖性没有影响。在申请被提交的1989年，以及它被公开的1993年，本领域的普通技术人员还不能制造如文献中所讨论的非常细的中空硅针。Liga法不适合生产中空的硅针，也不能在产品中产生坡度结构。

US 5 457 041公开了一种使用有不齐尖头(ragged tips)的硅所制成的固体的针的阵列。

US 5 591 139公开了在一个硅圆片平面上形成硅微针。

乔治亚技术学院的网站www.gtri.gatech.edu/resnews/NEEDLES.htnl上的文章，发表于1998年6月22日，讨论了由硅生产固体针阵列的方法，并表达了使用一种未知且未鉴定的方法来生产中空针的愿望。

US 4 969 468讨论了应用于与神经接触的固体金属针。

基于另一个方面，发明包含细胞穿透元件(cell-penetratingmember)，或称用多孔硅制成的微穿刺器(mocropiercer)。

细胞穿透元件适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。

基于另一个方面，本发明包含细胞穿透元件或微穿刺器，它们至少含一个区域的多孔硅。优选待转移的物质含DNA或RNA,DNA或RNA片段，或DNA或RNA的构建体。

细胞穿透元件或微穿刺器优选适于使用多孔硅携带即将转入细胞的物质。