[发明专利]病毒蛋白介导的植物对虫害的抗性

说明书

本申请要求了1998年9月14日提交的美国临时申请No.60/100,132的优先权。

                  联邦研究赞助声明

本发明至少是部分靠美国农业部合同No.97-34340-3987的基金而完成的。因此，美国政府在本发明中享有一定的权利。

                      发明背景

大多数植物病毒由昆虫载体传播。其它病毒是通过螨、真菌或线虫来传播的。感染昆虫的病毒如杆状病毒也通过病毒外壳蛋白作用从肠进入昆虫血腔。循环性传播的植物病毒进入昆虫传媒的血腔(体腔)。感染昆虫的病毒也进入血腔。在任何情况下，病毒都进化产生特化的蛋白以确保其在传媒体内存活。本发明打算利用这些病毒蛋白以及编码这些蛋白的基因来提呈和输送毒素或其它蛋白给病媒或有关的生物体。这可能适用于非病媒以及病媒的场合，因为在一些情况下，病毒通常与非病媒的血腔相互作用并进入血腔。而且，病毒蛋白可经修饰而能与自然界存在的众多生物体相互作用。通过有效地输送毒素，本发明可用来基因工程改造抗害虫的植物或用来构建生物杀虫剂。

植物病毒可以循环或非循环方式传播。我们将循环性传播广义地定义为“任何植物病毒必须以主动方式输送通过病媒的膜并在待传播的病媒中存活”(Gray,S.M.[1996]Trends in Microbiology 4:259-264)。通过该定义，即使是某些真菌也可认为是循环性传播的病媒。通常，在本领域中，病毒被理解为可分类成具有共同遗传特征、结构等的组。运输通过昆虫病媒膜的病毒组的例子包括：托斯泊病毒组(tospovirus)、植物呼肠弧病毒、植物棒状病毒组、水稻条纹叶枯病毒组、玉米雷亚多非纳病毒组、黄矮病毒组、双生病毒组、伊奈莫病毒组(enamoviruses)、芜菁黄花叶病毒组、豇豆花叶病毒组和南方菜豆花叶病毒组(同上：Gergerich,R.C.和Scott,H.A.[1991]Advances inDisease Vector Research.Harris,K.F.编辑，114页，Springer-Verlag)。通过真菌传播的病毒包括bymoviruses和真菌传棒状病毒组(前引书；Jianping等人[1991]Annals ofApplied Biology 118:615-622)。本发明包括所有这些病毒以及能获得这些病毒的病媒和非病媒。

本文所用的术语“黄矮病毒”包括黄矮病毒科(Luteoviridae)的所有病毒，包括主要的病毒属：黄矮病毒属(Luteovirus),Polerovirus和Enamovirus。本文实施例中描述的大麦黄矮病毒(BYDV)的RPV病毒株也称为“谷类黄矮病毒-RPV”，分类在Polerovirus属中(最近命名有变化)。然而，由于大多数相关领域称为BYDV，因此本文中保留该命名。

非循环性传播的病毒“与昆虫的口器或前肠的表皮衬层结合，当昆虫开始进食时，昆虫将消化性分泌物排入植物中。这些病毒既不主动运输通过病媒的细胞膜，病媒内部也不携带这些病毒。昆虫(以及线虫)的外部表皮衬层深深地延伸入口器和前肠，但在动物蜕皮时脱落(Gray,S.M.[1996]Trends in Microbiology 4:259-264)。尽管本申请列举了用植物病毒蛋白来向血腔输送毒素，但是非循环性传播的病毒也可以类似方式将毒素呈递到肠或口器的表面。理论上，如本文所述的能通过病毒蛋白的作用从肠进入昆虫血腔的病毒均可用来向昆虫输送毒素。

本发明列举了黄矮病毒及其蚜虫病媒。它们具有经彻底了解的循环性传播的病毒病媒相互作用。然而，相同的原理可应用于任何病毒-病媒相互作用，它们在开发昆虫抗性植物上的应用包括在本发明中。

黄矮病毒只能通过蚜虫来传播。传播机制是持续性和循环性的。病毒进入蚜虫的体腔(血腔)，并在蚜虫的一生中保持在哪里。蚜虫通过摄食受感染植物而获得该病毒。病毒颗粒(毒粒)通过假定的受体介导过程穿过后肠上皮细胞从蚜虫后肠输送到血腔内。然后，病毒穿过两个以上的膜屏障从血腔输送到副唾液腺(ASG)(Gildow,F.E.等人，[1993]Phytopathology 83:1293-1302；Power,A.G.等人[1995]《大麦黄矮病：40年的进展》St.Paul:APS Press,259-289页)(图1,2)。随后，蚜虫每次摄食时，将充满病毒的唾液分泌到植物细胞中来传播病毒。