[发明专利]炎症疾病的治疗

说明书

本发明涉及炎症而且特别是风湿性关节炎。

风湿性关节炎(RA)是一种滑膜关节的慢性炎症，它导致关节毁坏、伤残、及较早死亡。目前虽然风湿性关节炎(RA)的病因还不清楚，有人提出在关节的软骨中唯独发现的II型骨胶原可能是风湿性关节炎(RA)的自身免疫抗原。最近，有人提出gp39(一种39KD的糖蛋白)和由此衍生的肽就是这样一些自身免疫抗原。可是支持这种假说的资料有限，因此，gp39的作用仍然不确定。

本发明来自一种不同的途径，基于软骨细胞(一种关节软骨特异性细胞)的研究。我们从人软骨细胞和人软骨肉瘤细胞细胞系分离到一种蛋白质，该蛋白质与风湿性关节炎(RA)的病人血清中的抗体作用，并满足被称之为自身免疫所接受的标准。对该纯化的蛋白质进行了T细胞的增殖试验，而且表明对风湿性关节炎病人滑膜T细胞有选择性增殖。该蛋白质是免疫球蛋白重链结合BiP蛋白质(78KD)(immunoglobulin heavy chainbinding protein BiP(78KD))。

国际专利申请WO99/18131提出对海拉(HeLa)细胞得到的BiP的抗体检测作为风湿性关节炎的诊断指标。但是，已有技术没有描述从HeLa细胞提取BiP的方法，因此不能满足实际应用。

现在我们已经得到并且鉴定了正确的风湿性关节炎(RA)自身免疫抗原，而且基于该发现开发了对这种疾病的预后和诊断的测定方法以及特殊的治疗方法。我们已经分离了该蛋白质和测定了该蛋白质的DNA序列。我们也已经克隆并表达了这种DNA。其氨基酸和DNA的序列是新颖的，它们的序列在本发明说明书后附的序列表中给出。BiP蛋白质的氨基酸序列以SE1和SE2两种形式列出，任其一种都可以按照本发明用作为检测试剂。SE1的cDNA是以SE3序列给出的。该序列已经存放于基因库(GENBANK)，登记号为NO AF188611。

下文，该序列与基因库(GENBANK)提供的NOX87949进行比较。

下文第一部分描述的是关于这种自身免疫抗原；第二部分是关于克隆、序列测定和蛋白质的表达；第三部分是关于疾病(风湿性关节炎)的示范和组织(滑膜腔)T细胞对自身免疫抗原的特异性。

第一部分：自身免疫抗原的表征

软骨细胞和软骨肉瘤细胞

软骨细胞是从关节置换取出的软骨中分离的。软骨被精细地切碎，用胶原酶(Worthington)1毫克/1毫升进行消化。消化后，细胞以300g离心，然后悬浮于添加了10％胎牛血清(FCS)(Harlan Sera-Lab，Loughborough，UK)的Dulbeccos最低基础培养基(DMEM)(LifeTechnology，Paisly，UK)中。24小时后，从附着细胞中洗去细胞碎片，使细胞生长至汇合。用0.25％胰蛋白酶和按1∶3的比例进行传代。

软骨肉瘤细胞(HTB94)(SW1353)是由美国典型培养物保藏中心ATCC(Rocville，Maryland，USA)和美国芝加哥鲁什大学(Rush University)的J.Block，博士个人提供。这些细胞是培养在含有10％的FCS的DMEM培养基中，当细胞布满时，经过温和地胰蛋白酶水解作用(0.25％胰蛋白酶Life Technology，Paisley，UK)后，用0.25％胰蛋白酶和按1∶3的比例分散细胞。

细胞裂解液的制备

细胞从培养瓶中刮下，在蛋白酶抑制剂PMSF(2mM)，亮肽素(200ug/ml)和抑蛋白酶肽(50ug/ml)(Sigma，Pool，UK)的存在下进行细胞匀浆和超声破碎。

十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma，Pool，UK)最终浓度加到1％，在室温溶解蛋白质1小时。蛋白质浓度以牛血清白蛋白作标准用bicinchoninic酸检测的方法进行测定，细胞裂解液以10ug/孔的等份使用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western Blot

凝胶电泳采用Mini Protean系统(BioRad Laboratories，HemelHempstead，UK)制备5，7.5，10％的SDS聚丙烯酰胺1.5mm厚度的变性胶(参见附录1)。每个胶孔加入10μg的蛋白质或等量加入制备胶。电泳在恒定的100V电压及宽范围Kaleidoscope标准蛋白质(BioRad)与细胞水解物平行进行电泳。