[发明专利]猪促生长素传递系统

说明书

发明领域

本发明涉及传递外源多肽至宿主中的表达构建体。本发明还涉及包括该表达构建体的重组细胞和包括该重组细胞的半渗透胶囊。

发明背景

在哺乳动物中，促生长素(生长激素)通常由脑垂体分泌。但是，已经证实向猪给予外源促生长素会提高摄食效率15-20％，增加日增重10-15％，降低身体脂肪10-20％，增加瘦肉含量5-10％，降低摄食量。令人遗憾的是，促生长素(它是190个氨基酸的小蛋白质)对胃酸和蛋白降解敏感，因此需要每日注射才会有效果。当前，福利和道德的考虑使得使用气动pST注射枪不受欢迎，每日用药的费用也限制了其大规模的使用。

基因治疗的最新进展已经发展出了新的策略，无需依赖自体靶细胞和免疫抑制治疗，而使用包封在半渗透藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐(APA)膜中的转染细胞。APA胶囊环境允许细胞存活和生长，因此转染细胞保持存活并在较长时间内分泌生长因子。APA对小蛋白是可通透的，因此基因表达可以通过外源机制控制。APA屏障抑制免疫监视和细胞排斥事件，从而可以在胶囊中使用非宿主、高表达细胞。APA屏障也可能阻止宿主受体中转染细胞不受控制的增殖。APA胶囊可以取出，可能还可以再次使用，从而打消对于食用转基因材料的担忧。而且，如果胶囊被严重的组织创伤损害，正常的宿主-移植物排斥就会摧毁植入的细胞。

发明概述

发明人现已发现，在基因序列导入宿主细胞中之前，胰岛素分泌信号与异源基因序列的连接导致外源基因产物分泌水平出乎意料的增长。这一发现已经导致开发出了改进的基因传递系统，包括包封重组细胞植入宿主中。

因而，第一方面，本发明提供了一种表达盒，包括编码胰岛素分泌信号的序列，其与编码一种多肽的异源序列有效连接。

“异源序列”是指不是编码胰岛素的序列的序列。

“有效连接”是指胰岛素分泌信号序列与异源编码序列邻接并位于同一阅读框。

优选的胰岛素分泌信号是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的胰岛素分泌信号。但是，本领域技术人员会认识到，可以对分泌信号进行多种修饰而不会对信号的生物活性有不利影响。例如，这可以通过在肽序列中进行各种改变或通过保守或非保守的氨基酸插入、缺失和取代(如D-氨基酸，脱氨基酸)实现，所述改变如硫酸化、磷酸化、硝化和卤化，只要这些改变不会对分泌信号的总体生物活性有不利影响。因此，在表达盒中包括已经以上述一种或多种方式修饰的胰岛素分泌信号被认为包括在本发明之中。

异源序列可以编码除胰岛素以外的目标多肽。例如，异源序列可以编码激素、细胞因子、受体激动剂或拮抗剂、信息素或酶。在优选实施方案中，异源序列编码生长激素。优选，生长激素是促生长素。

本发明第二方面提供了包括第一方面的表达盒的载体。该载体可以是将表达盒导入细胞的任何合适的载体。合适载体包括病毒载体和细菌质粒。

本发明第一方面的表达盒或第二方面的载体还可以包括一个或多个调控基因表达的元件。合适调控元件的实例包括褪黑素应答元件(MRE)(见Schrader et al.,1996，此处全文引入作为参考)，和/或雷帕霉素介导转录因子(见Magari et al.,1997，此处全文引入作为参考)。在优选实施方案中，调控元件可以实现目标多肽的脉动表达。

本发明第三方面提供了一种重组细胞，它包括本发明第一方面的表达盒。

重组细胞可以是细菌、真菌、昆虫或哺乳动物细胞。在优选实施方案中，重组细胞是哺乳动物细胞。在进一步优选的实施方案中，细胞是大鼠成肌细胞(L6)。

本发明第四方面提供生产多肽的方法，包括在可以表达和分泌所述多肽的条件下培养第三方面的重组细胞，可选地包括分离该多肽。

本发明的重组细胞可以包封在半渗透基质中以传递或植入人体。

因此，本发明第五方面提供植入宿主的胶囊，该胶囊包括包封本发明第三方面的一种或多种重组细胞的半渗透膜。

在优选实施方案中，半渗透膜是藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐(APA)膜。APA半渗透膜的制备见Basic et al.,1996，该文献全文引入作为参考。

本发明第六方面提供向宿主给予多肽的方法，包括向宿主给予本发明第一方面的表达盒。

本发明第七方面提供向宿主给予多肽的方法，包括在宿主中植入本发明第五方面的胶囊。

宿主可以是任何动物或人。在优选实施方案中，宿主是家畜。在进一步优选的实施方案中，宿主选自放牧牛、圈养牛、奶牛、猪和家禽。