[发明专利]一种来自唐德链霉菌的抗植物致病性真菌的抗真菌蛋白质的用途

说明书

本发明涉及一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌(Streptomyces tendae)的抗来自子囊菌(Ascomycetes)科的植物致病性真菌的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。

抗真菌蛋白质在前些时候曾经被描述过，在植物中这类蛋白质中的一些也被称为PR蛋白质(植物发病机理相关蛋白质)(Bol,J.F.&Linthorst,H.J.M.(1990)，植物病理学年度综述(Annu.Rev.Phytopathol.),28,113)。这些蛋白质是植物在应激反应条件下形成的，例如在病毒或真菌感染的情况下，诱导出一种被称为“诱导抵抗力”的植物的活性防御机制(Lindhorst,H.J.M.,(1991)植物科学评论综述(Cri.Rev.Plant Sci.),10(2),123)。这些蛋白质中有一些具有例如壳多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。

具有一种抗真菌活性的蛋白质也已经从微生物中检测到，这些蛋白质中有些也显示了壳多糖酶活性或β-1,3-葡聚糖酶活性。而其它蛋白质通过与真菌细胞壁的相互作用来发挥作用。

例如，已经从唐德链霉菌中分离出一种大小约为10kDa的抗真菌蛋白质(AFP)，其具有抗真菌种类如拟青霉(Paecilomycesvarriotii)、Byssoclamis nivea、软毛青霉(Pencillium puberulum)和Eupenicillium terrum的活性。但是这种作用也只限于这些种类。其它种类，如肉色拟青霉(Paecilomyces carneus)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacenus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)或棒形青霉(Penicillium claviforme)则不被抑制。另外，AFP的使用不具有商业价值也是因为所提到的这些真菌种类不是植物致病性的。

因此本发明的目的就是要找到对植物致病性真菌有活性的一种抗真菌蛋白质。

令人惊喜的是，现在已经发现来源于唐德链霉菌的AFP具有抗来自子囊菌科的植物致病性真菌的活性。

所以本发明的主题就是一种分子量约为10kDa的来源于唐德链霉菌的抗来自子囊菌科的植物致病性真菌，尤其是抗灰葡萄孢(Botrytiscinera)的抗真菌蛋白质(AFP)的用途。

上述抗真菌蛋白质包含一个典型的氨基末端信号序列，即在亲水性N-末端之后跟着的是疏水性跨膜区，其引起胞外分泌。而且已知有两种类型，即一种分子量约为9 860 Da的较短的类型和一种分子量约为10 300 Da的较长的类型。

既然AFP被唐德链霉菌分泌到培养基中，它就可以依本领域技术人员周知的方法例如从唐德链霉菌培养基滤液中直接分离。作为一种可供选择的方法，AFP可以通过遗传工程生产，分离到的基因优选地被克隆到所谓的多拷贝载体上，例如pIJ702(Hopwood,D.A.等。(1985)链霉菌遗传操作实验指南，Norwich，英国)并且使用这一结构来转化适宜的菌株，例如非烟霉素产生菌的唐德链霉菌NP9。一种编码AFP的核酸的例子示于SEQ ID NO.1中。这种优选的转化子在例如200ml培养液中生长7天大约可获得6mg的AFP，相当于30mg AFP/L。因此通过优选的可控发酵用遗传工程来生产AFP是尤其优选的。

就根据这一发明的用途而言，AFP可以以例如与优选的至少一种额外辅料一起的制剂形式直接应用。为了这一目的，例如被真菌侵袭的或有被真菌侵袭危险的植物可用所述制剂喷洒。制剂的AFP浓度通常是从大约10μg/ml到大约500mg/ml。象蛋白酶抑制剂、稳定剂例如甘油、蔗糖、盐、溶剂或通常所知的来自农作物保护领域的物质可作为适宜的辅料。

能自身产生AFP的所谓的转基因植物是可提供抗真菌感染保护的另一种可能性。

因此另一个实施方案是按照发明的AFP的用途，在转基因植物中产生AFP。转基因植物优选的是遗传工程化的玉米，棉花，马铃薯，香蕉，芥属(Arabidopsis)，木薯(casava)，烟草，油籽油菜(canola)，马铃薯，甜菜，谷类如小麦、大麦、或燕麦，草莓，蔬菜如卷心菜，豆科植物如豌豆或黄豆，番茄，莴苣或甜瓜。