[发明专利]腺病毒介导的基因治疗

说明书

发明领域

本发明涉及使用基因疗法治疗脑肿瘤。

发明背景

恶性神经胶质瘤的治疗对于内科医生和科学家们仍是一种挑战。胸苷激酶基因治疗(使用单纯性疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因)是最有希望的治疗形式之一，试图改变恶性神经胶质瘤患者的存活。HSVtk基因治疗是基于胸苷激酶催化9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(GCV)磷酸化的能力。磷酸化的GCV起到一种有毒性的核苷酸类似物的作用，导致目标细胞的死亡。这一现象通过旁观者效应进一步得到增强，其中邻近的细胞即使没有获得转染仍被破坏。一般认为这种效应是由于转染细胞有毒性的核苷酸类似物通过接点间隙释放到邻近的细胞。

逆转录病毒和腺病毒一直用于基因治疗的载体。两种载体都具有某些优点和缺陷。脑肿瘤特别适合用逆转录病毒介导的基因转移，因为逆转录病毒只感染增殖的细胞，而正常的、非分裂的脑组织保持完整。逆转录病毒的基因转移效率相对较低，但通过使用逆转录病毒包装细胞而不是孤立的病毒能提高逆转录病毒的基因转移效率。理论上能延长转导时间并且转染细胞的数量增加。和逆转录病毒一起，转染的基因整合到目标细胞的基因组中并且可获得长期的基因表达。

发明概述

本发明是基于如下的出人意料的发现：如果使用腺病毒作为载体将基因转移到肿瘤细胞中能更有效地实现使用胸苷激酶基因疗法治疗脑肿瘤。

根据本发明，腺病毒包含了编码胸苷激酶的基因，且包含其的药物对治疗脑肿瘤有用。尤其在施用9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或等效化合物之后治疗肿瘤。

一般胸苷激酶基因得自单纯性疱疹病毒(HSVtk)。

腺病毒/胸苷激酶基因构建体比逆转录病毒基因转移显示了更多的优点。发明详述

本发明的构建体可用于治疗肿瘤。治疗可以包括步骤：

(ⅰ)施用包含编码胸苷激酶基因的腺病毒到肿瘤腔的壁中；并且

(ⅱ)施用当磷酸化时形成细胞毒性化合物的化合物。

步骤(ⅱ)中使用的化合物可以是9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤或其衍生物。可以使用这种方法治疗任何肿瘤，优选脑肿瘤，例如恶性神经胶质瘤。步骤(ⅰ)中使用的组合物可以反复施用，优选40到80个单独的应用。

用于本发明的组合物的配制优选不加蛋白质(不同于那些与腺病毒相关的)。据信加入用以降低降解酶类对活性组合物之作用的白蛋白的那些组合物是优选的。优选地，这种组合物包括作为稳定剂的甘油。

在本发明中，基于在此处提供的信息和通常的考虑(如施用途径，治疗条件及其状态等)，本领域技术人员能确定应该给患者施用的活性产物的量。

下面的实施例阐明了本发明。

实施例

在这个实施例中，比较了逆转录病毒包装细胞介导的和腺病毒介导的HSVtk基因疗法治疗恶性神经胶质瘤的安全性和效能。在试验中，与lacZ转染的对照组相比，逆转录病毒包装细胞的基因治疗不能提高恶性神经胶质瘤患者的存活。在肿瘤切除和基因转移三个月后，当通过核磁共振成像(MRI)评估时在所有的患者中都存在肿瘤的发展。但是，腺病毒基因治疗明显改善了患者的结果。此外，七个用腺病毒治疗的患者中有三个的核磁共振成像显示了肿瘤保持稳定。逆转录病毒和逆转录病毒包装细胞系

如Poptani等，肿瘤基因治疗(Cancer Gene Ther.)5:101-109(1998)所描述的那样制备一种PA317/tk包装细胞系。扼要地，将1.2 kb HSV1-TK cDNA(McKnight，核酸研究(Nucleic Acid Res.)8:5949-5964(1980))亚克隆到pLXSN逆转录病毒质粒(Miller等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.),5:2985-3902(1986))上以产生pLTKSN质粒。HSV1-TK的表达由5＇莫洛尼氏鼠肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)来启动。载体也包含一个内部SV40启动子以驱动新霉素抗性(NEO)基因。使用磷酸钙沉淀法用pLTKSN质粒转染PA317细胞系。象在209F成纤维细胞分析(Yla-Herttuala等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95:2692-2698(1995))中确定的那样，PA317/3.0D5细胞系(PA317/tk)产生106个cfu/ml逆转录病毒。注射前，扩增和用胰酶消化包装细胞并稀释到10⁹个细胞/10ml Optimen(Gibco BRL)。细胞显示不含支原体、其它微生物污染物和野生型病毒。