[发明专利]重组细胞的制备方法

说明书

发明的领域

本发明涉及一种能表达至少一种氨基酸序列的重组细胞的制备方法。本发明具有广泛应用性，包括用于制造具有稳定性及可表达高产量的所需蛋白的重组哺乳类细胞。

发明的背景

目前已有许多制备高产量的所需氨基酸序列的尝试，借助导入外源(异种)(heterologous)核酸进入宿主细胞内，并表达宿主细胞内的核酸。真核细胞，特别是哺乳类细胞已被加以应用而产生混合的结果。例如，尽管有许多改良的高产量氨基酸序列的重组哺乳类细胞的制造方法，但大多数细胞并无法表达足够量的核酸。因此，在此领域仍迫切需要可以高表达经导入核酸的重组哺乳类细胞的制备方法。

一般而言，有二种方法可被用来增加哺乳类细胞的异种核酸表达。其一为藉由如抗药性扩增细胞筛选技术以增加该异种核酸的拷贝数量。其二为藉由如重组技术向该核酸中增加一种或更多有益控制元素，以增加细胞内该核酸的表达。参见Kaufman，R.J.及P.A.sharp于1982年发表的“分子生物期刊”(J.Mol.Biol 159：601)；Sambrook等人于1989年发表的“分子克隆”(Molecular Cloning)(第2版)、及Ausubel等人于1989年发表的“分子生物近期报告”(Current Protocols inMolecular Biology)(John Wiley&Sons，New York)。

特别是对于抗药性扩增，已有报告提出它涉及到二种基因的细胞转化，其中一种基因为编码标的氨基酸序列，如异种蛋白质；另一种基因为编码选择性基因标记(selectable gene marker)，如二氢叶酸还原酶(DHFR)。在该基因标记为DHFR的情形下，将转化细胞在选择氨甲蝶呤(MXT)药物之存在下培养。一般该MXT的细胞毒性可藉由上述DHFR的表达而予以显著地移除。转化细胞得以存活，是因其增加(扩增)DHFR拷贝数量至足够高的数量。而编码所需氨基酸序列的核酸序列亦被扩增，因此能以高表达该所需氨基酸的序列。参见前述的Kaufman，R.J.与P.A.Sharp文献。

然而，抗药性扩增及相关技术已普遍认知它具有若干缺点。例如，使用该技术会产生绝大多数的重组哺乳类细胞系(cell line)相当耗时，且需耗费数月之久。另外，已知当欲扩增异种核酸时，将负向影响到标准核酸定序的方法。另外，当需要面临长期严格的筛选压力时，很难维持足量的核酸拷贝数量。对于细胞筛选策略上，筛选期间的延长会增加费用，例如制备异种蛋白质以做为医药用途时，还会出现一些涉及法律规定等问题，除此之外，借助抗药性扩增并无法增加特定异种核酸的表达量，而使该核酸产生量不足以供研究或商业所需。

另外关于抗药性扩增的问题也包含经克隆细胞系的基因不稳定性，这样的问题亦非常显著。例如，此方法常常制造出来自不稳定基因的扩增所产生的重组细胞，如形成双微小染色体(double minute chromosomes)。当去除具筛选药物时，这些细胞可能丧失所需的特性。参见Kaufman，R.J等人于1985年发表的“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol.5：1750)所引证的参考文献。

除此之外，大部份抗药性扩增技术最佳应用上需使用高特异性的细胞、载体及/或细胞生长条件。例如，大部份方法使用到以特殊方式基因操作处理的宿主细胞。这种突变细胞并不适于某些应用上。如前述的困难度涉及DHFR及MTX的抗药性扩增作用即无法适当作用于带有正常DHFR基因的细胞上，而要移除该正常基因功能时常需经过耗时费力的处理。参见Wigler等人于1980年发表的(美国)国家科学研究院会刊[PNAS(USA)]3567，及Urlaub与Chasin于1980年发表的(美国)国家科学研究院会刊77：4216。

有关使用于特殊载体及生长条件的DHFR/MTX扩增方法，已披露若干缺点。参见如上文所提及的Kaufman与Sharp发表的文献；及Schimke，R.于1984年发表的“细胞”(Cell，37：705)。以及美国专利号5,686,263、4,956,288、5,585,237和其中的参考文献。

因此对于能制造富变化性的重组细胞、及制造具基因稳定性重组细胞系等方法，相当具有实用性。特别是需要一种制造能显著降低或避免使用到高特异性的细胞、载体及/或细胞生长条件等重组哺乳类细胞系的方法。更需要一种由可制备高产量标的氨基酸序列，如异种蛋白质的方法制得的重组哺乳类细胞。

发明概述