[发明专利]用腺病毒突变体杀伤肿瘤和肿瘤相关内皮细胞的方法

说明书

                    发明领域

此处所述的本发明涉及用与静息细胞相比可在过度增殖的或不受控制的细胞中选择性复制的具有复制能力的腺病毒突变体，对与这些细胞生长有关的疾病优选地癌症的治疗或预防。

                    发明背景

人类癌症的主要特征是不受控制的细胞生长和原发肿瘤的转移。最近的研究表明，不受控制的细胞生长与细胞周期校验点(checkpoint)调节的功能丧失有关。见，Hartwell，L.H.和Kastan，M.B.，科学(Science)266，1821-1828(1994)。例如，成视网膜细胞瘤基因产物(RB)和有关蛋白质在防止正常细胞从G1期进入S期中起重要作用，直到接收到适当的增殖信号为止。相反，RB功能似乎在几乎所有癌细胞中丧失，这是由于RB或p16基因突变/缺失、细胞周期蛋白D扩增/过量表达或cdk4扩增/过量表达的结果。见，Sherr，C.J.，科学274，1672-1677(1996)。因此，RB途径的缺陷不能控制细胞的生长，而使正常细胞表现恶性表型。通常与恶性状态相关的是癌细胞转移的能力。

腺病毒5 E1A基因编码两种沉降值为13S和12S的mRNA，这是由于一种共同前体的不同剪接引起的，并且编码分别含有289个和243个氨基酸的蛋白质。这两种蛋白质之间46个氨基酸的差异是由于13S的种类。据认为E1A是通过结合细胞RB转化细胞，从而消除了其肿瘤抑制功能。

E1A基因显示编码几种不同的生物学活性。在一种情况中，与SV40病毒的中T抗原或活化的H-ras基因产物结合后它能转化细胞。相反，更新的研究表明，它能抑制与某些癌基因相关的致癌表型。见，美国专利号5,651,964。已确定E1A基因的突变影响其抗癌活性，其中某些显示与化疗药物结合后有效。见，PCT/US97/19042。

Frisch证明了腺病毒E1A在人肿瘤细胞中的抗癌作用。见，Frisch，S.，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88卷，9077-9081(1991)。

美国专利号5,516,631描述了用编码具有腺病毒E1A活性的多肽的核酸抑制过度增殖细胞复制的方法。

PCT/US95/11342描述了一种用腺病毒E1A使肿瘤细胞对化疗剂敏感的方法。

美国专利号5,651,964、5,643,567、5,641,484和PCT/US97/03830描述了单独或与SV40大T抗原结合使用腺病毒E1A基因抑制表达neu癌基因的肿瘤的方法。

其他人证明，腺病毒E1A具有体内抗肿瘤作用。见，R.Sanchez-Prieto等人，癌基因(Oncogene)13：1083-92(1996)；和R.Sanchez-Prieto等人，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)5(4)，215-224(1998)。

血管生成对于肿瘤生长和转移至关重要。血管生成是原发性肿瘤的生长和转移及随后继发肿瘤的转移所必需的。即，肿瘤在没有血液供应来提供养分并除去代谢废物的情况下不能保持持续的生长。因此，新血管的形成，或血管生成，有利于肿瘤细胞生长，使肿瘤细胞得以进入血流并在全身循环。因此，血管生成的抑制或预防预计是一种有效的防止肿瘤生长和转移的方法。

值得注意的是，作为血管生成过程的一部分，肿瘤相关内皮细胞增殖，而与正常组织相关的内皮细胞基本上静止。因此，针对分裂的细胞即癌细胞及其相关微血管内皮细胞的治疗剂比只针对任一细胞型的治疗剂有更强的抗肿瘤作用。显然，具有这种特性的病毒剂，即可在靶细胞中复制从而杀伤靶细胞，并在此过程中释放能扩散并攻击其他靶细胞的新病毒颗粒的病毒剂，将有重要的医学应用。

                    发明概述

根据前述，本发明提供一种方法和具有复制能力的腺病毒突变体，其用于治疗或预防不受控制的、过度增殖的细胞生长的疾病。

本发明的一个方面提供了一种方法和具有复制能力的腺病毒突变体，其用于治疗或预防不受控制的或过度增殖的细胞生长的疾病，优选地那些需要或由血管生成引起的疾病，包括癌症。

在本发明的另一方面中，与野生型腺病毒相比，具有复制能力的腺病毒突变体在分裂的正常细胞或癌细胞中能有增强的复制，其中这些突变体在E1A的RB家族成员结合区中具有突变。