[发明专利]用于植物中的诱导型表达系统

说明书

本发明涉及一种用于植物中的表达系统，特别是一种利用外源性化学药剂作为控制机制的表达系统，和某些化学品作为所述控制剂的用途。

基因表达是通过蛋白编码区域上游(5’)的区域控制的，通常称为“启动子”。启动子可以是组成型的，组织特异性的，发育编程型的或诱导型的。

为了提高性能(如生产率或质量)，农作物的操纵需要植物组织中的外源或外源性基因的表达。因此，这种基因的操纵依赖于方法的有效性，以按照需要控制基因表达；例如，依赖于在植物中有效的适宜启动子的有效性和用途。具有各种不同启动子的选择是有利的，以便对于特定的基因，构建体，细胞，组织，植物或环境可以选择最适宜的启动子。已知一系列启动子在植物中是有效的。

在某些情况中，特别有效的启动子是通过外源性化学诱导物的施用诱导的启动子。在有或没有施用于植物或种子的化学药剂的情况下，这允许将在植物生长和发育的特殊阶段控制特殊基因的表达，例如通过喷雾或使用已知的种子包被技术。有时，这被称为基因“开关”。

在诱导型启动子控制下的基因可能是引起其所期望的性能或表型的基因，或者诱导型启动子可以控制阻抑蛋白的表达，该阻抑蛋白抑制靶基因的表达，例如通过与靶基因的操纵序列上游相互作用以阻止基因的表达(例如在细菌中已知的tet和lac操纵基因/阻抑物系统)。在另一选择中，在诱导型启动子控制下的基因可以表达与另一个蛋白相互反应的蛋白，以抑制其活性，例如在芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂系统中，在没有芽孢杆菌RNA酶抑制剂的情况下，芽孢杆菌RNA酶将抑制或杀死细胞。

这种类型的基因开关在若干广泛的应用中是已知的。这些包括可逆的雄性不育的产生，即WO90/08830中举例描述的，在杂交植物生产中高度期望的特征。这种启动子的其它应用包括在种质保护中，其中特殊农作物，特别是转基因植物的防范和自生自长植物的控制是必要的，及在WO94/03619描述的收获前出芽的预防中。

许多生物体具有让它们代谢化学制剂如醇或酮的机理，例如通过醇脱氢酶的生产。这些系统的启动子在基因开关中可能是有益的，因为启动子可以通过靶醇或酮的存在而被诱导。

这样的例子可以在真菌生物体构巢曲霉中找到，仅仅当它在有各种醇或酮的情况下生长时，构巢曲霉表达通过基因alcA编码的醇脱氢酶I(ADHI)。可以通过alcR基因编码的调节蛋白接替诱导并组成型地表达。在有诱导物(醇或酮)的情况下，调节蛋白激活alcA基因的表达。调节蛋白也在有诱导物的情况下刺激它自身的表达。这意味着ADHl酶的高水平是在诱导条件下(即当醇或酮存在时)产生的。相反地，alcA基因和其产物，ADHl，在没有诱导物的情况下是不表达的。alcA的表达和酶的生产在有葡萄糖的情况下是阻抑的。

因而，alcA基因启动子是一种诱导型启动子，是在有诱导物的情况下(即通过蛋白/醇或蛋白/酮的结合)通过alcR调节蛋白激活的。已经克隆和测序了alcR和alcA基因(包括各自的启动子)(Lockington RA et al，1985，Gene，33：137-149；Felenbok B et al，1988，Gene，73：385-396；Gwynne et al，1987，Gene，51：205-216)。

已经在某些植物物种中研究了醇脱氢酶(adh)基因。在玉米或其它谷类中，它们是通过缺氧情况接通的。源自玉米的adh基因的启动子区域包含在缺氧情况下表达所必需的300bp的调节元件。然而，已经发现在任何植物中均没有alcR调节蛋白的等效物。因此，基因调节系统的alcR/alcA类型在植物中是未知的。植物细胞中alcR的组成表达没有导致内源性adh活性的激活。

WO93/21334描述了转基因植物的生产，该植物包括作为基因开关的系统。此文献特别描述了化学-诱导的植物基因表达盒，该盒包含有效连接到调节序列上的第一启动子，该调节序列编码调节蛋白，且诱导型启动子有效地连接到靶基因上，在有有效外源性诱导物的情况下，通过调节蛋白激活诱导型启动子，由此诱导物的施用引起靶基因的表达。特别是，在构建物中利用alcR/alcA系统。应用于这种情况中的外源性化学诱导物包括那些通过Creaser et al.，J.Biochem.(1984)225，449-454描述的，如丁-2-一(乙基甲基酮)，环己酮，丙酮，丁-2-醇，3-氧代丁酸，丙-2-醇和乙醇。

为了农业的目的，醇通常用作外源性化学诱导物。然而，这种化学药剂通常是挥发性的，并因此在农业环境下难以处理，因为大量化学剂可能在喷雾过程中丢失。