[发明专利]蛋白质的共表达

说明书

相关申请的参照

这是1997年5月30日提交的共同未决申请08/866，879和1996年5月31日提交的临时申请60/020，424(现已放弃)的部分延续申请。

发明背景

紫苜蓿(Medicago sativa L.)广泛种植，具有极好的维生素和矿物质平衡，产量高，是生物学固氮的极好来源，而且作为有吸引力的蜜蜂花蜜来源(Barnes等人，1988；Smoliak和Bjorge，1983)，因而被认为是全世界最重要的种植饲料农作物(Hanson等人，1988；Michaud等人，1988)，常常被称为“饲料农作物王后”。为了其饲料品质和植物性能，苜蓿已培育多年。虽然苜蓿和其它豆科饲料农作物蛋白质含量高，但是这些植物缺乏含硫氨基酸(S-氨基酸)，甲硫氨酸和半胱氨酸(Kaldy等人，1979)。羊毛的生长显示受S-氨基酸可获得性的限制。相似的，产乳动物的乳生产受植物中S-氨基酸缺乏的影响。使用传统植物育种和细胞选择技术以提高苜蓿的S-氨基酸含量的努力尚未成功，或进展很小。

用于改进苜蓿和其它饲料农作物的氨基酸平衡的基因工程方法是，将编码富含甲硫氨酸蛋白质的基因导入这些植物，这些基因由叶启动子中的强组成性启动子驱动。为了显著改变豆科饲料的氨基酸平衡，外源蛋白应当包含大约15-25％的S-氨基酸，且占叶总蛋白质的5-10％。为了达到这些蛋白质积累水平，不仅需要确保基因转录和翻译的最大水平，还要确保蛋白质的稳定性。至于反刍动物的饲料农作物，瘤胃细菌和胃酶对含S-氨基酸蛋白质的消化能力对于为反刍动物提供适当的饲料农作物而言是非常重要的问题，但是常常被忽略。因此，富含S-氨基酸的蛋白质应当对反刍动物瘤胃(第一个胃)的降解相对有抗性，且应当在较低的胃肠道中被同化。

关于植物中营养改良的最集中的努力集中于种子蛋白质。由于玉米和其它谷类农作物不容易转化，所以致力于种子蛋白质修饰的大部分工作涉及测试转基因烟草(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)和爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)(Wallace等人，1988)中经修饰的谷醇溶蛋白的稳定性。还分析了转基因烟草和矮牵牛种子中含赖氨酸的α-玉米醇溶蛋白的合成(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)。发现正常和经修饰蛋白质都具有很短的半寿期。

为了改进豆科种子蛋白质的S-氨基酸含量的努力包括将含6个甲硫氨酸密码子的45bp寡核苷酸导入β-菜豆蛋白基因的第三个外显子。包含该经修饰基因的转化子显示，高甲硫氨酸的菜豆蛋白以与正常蛋白质相同的水平合成，但是非常不稳定，而且迅速转化(Hoffman等人，1988)。β-菜豆蛋白中额外氨基酸的导入可能引起其二级结构的变形，使之更容易被蛋白水解作用所降解。DeClercq等人(1990)用三种不同的高甲硫氨酸编码片段取代了芥属2S清蛋白第六个和第七个半胱氨酸残基之间的23个氨基酸的编码片段。将这些经修饰的拟南芥2S基因转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)、B.napus、和烟草中。种子中有一些蛋白质积累，但是不如预测得多(M.Chrispeefs，个人通讯)。已经将含多达19％甲硫氨酸、且由β-菜豆蛋白基因启动子驱动的巴西坚果2S清蛋白基因导入烟草(Guerche等人，1990)、芸苔(Altenbach等人，1992)、和大豆(Pioneer种子公司)。最近，Saalbach等人(1994)合成了2S清蛋白基因并将其连接在CaMV 35S启动子之后。导入烟草和一些谷类豆类后，基因在植物叶中显示最高表达水平，且蛋白质位于液泡。然而，巴西坚果清蛋白极易引起过敏，不会被接受用于消费。

用于在植物中增加特定氨基酸库的一种方法是，将编码氨基酸生物合成途径中的重要调控酶的细菌基因导入植物。将编码经脱敏以反馈赖氨酸和苏氨酸抑制的天冬氨酸激酶的细菌基因与β-菜豆蛋白基因启动子融合，并导入烟草。转基因烟草的种子显示游离苏氨酸和甲硫氨酸水平升高(Karchi等人，1993；Galili，1995)。

关于改进饲料农作物的蛋白质品质，做了很少的努力。Schoeder等人(1991)将由CaMV 35S启动子驱动的小鸡卵清蛋白基因(cDNA)导入苜蓿。然而，转基因苜蓿植物在叶中显示很低的蛋白质积累水平(0.005％)。还未确定这种蛋白质丰度这么低的原因。