[发明专利]碳同化的调节

说明书

                         发明背景

发明领域

本发明涉及具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的多肽，该多肽不需要乙酰辅酶A来激活，且对天冬氨酸的反馈抑制不敏感；本发明还涉及编码该多肽的基因。本发明也涉及含有这些基因的重组DNA分子、用这些基因转化的细菌、以及用该转化细菌产生氨基酸的方法。

相关技术

磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶(EC 4.1.1.31)是一种在几乎所有细菌和所有植物中存在的酶。PEP羧化酶催化三碳的糖酵解中间物PEP和二氧化碳之间的缩合反应，导致形成四碳的草酰乙酸(OAA)，一种为三羧酸(TCA)循环和L-天冬氨酸生物合成所共有的代谢中间物。TCA循环需要不断补充四碳分子，以替代氨基酸合成所消耗的该中间物，而生物素依赖性PEP羧化酶通过在给TCA循环提供OAA中起回补作用来帮助完成此功能。

OAA是产生细胞代谢物的很重要的物质，这些代谢物的例子有氨基酸，特别是谷氨酸家族(即谷氨酸、精氨酸和脯氨酸)和天冬氨酸家族(即天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸)。通过催化导致形成OAA的反应，PEP羧化酶在经代谢过程提供有机酸中起重要作用。例如，PEP羧化酶超量表达显著增加大肠杆菌(Escherichiacoli)从葡萄糖发酵产生琥珀酸。见Millard，C.等，Appl.Environ.Microbiol.62：1808-1810(1996)。因此，PEP羧化酶也在产生由谷氨酸和天冬氨酸形成的氨基酸中起重要作用。

氨基酸是细胞中普遍存在作为蛋白质成分的化合物。但是为了能量代谢和物质代谢的经济，其产生被严格控制。该控制主要是反馈控制，其中代谢途径的终产物抑制催化该途径早先步骤的酶的活性。PEP羧化酶也在其活性表达中接受各种调节。

例如，就短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)微生物的PEP羧化酶而言，PEP羧化酶活性被天冬氨酸抑制。见例如Mori，M.等，J.Biochem.98：1621-1630(1985)；O’Regan，M.等，基因(Gene)77：237-251(1989)。因此，PEP羧化酶参与的上述氨基酸生物合成也被天冬氨酸抑制。但是，已描述了对天冬氨酸敏感性降低的棒杆菌属微生物PEP羧化酶活性。见Eikmanns，B.J.等，Mol.Gen.Genet.218：330-339(1989)。

除了被天冬氨酸变构抑制外，乙酰辅酶A(乙酰-CoA)是例如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和大肠杆菌的PEP羧化酶的变构激活物。见Mori，M.等，J.Biochem.98：1621-1630(1985)；Morikawa，M.等，J.Biochem.81：1473-1485(1977)。不被天冬氨酸或乙酰辅酶A调节的其它生物的PEP羧化酶也有报道。见Valle，F.等，J.Indus.Microbiol.17：458-462(1996)；O’Regan，M.等，基因77：237-251(1989)；Vance，C.等，Plant Physiol.75：261-264(1984)。

因为回补酶PEP羧化酶对于最佳OAA库维持是关键的，并由此决定了来自OAA的氨基酸的生物合成水平，所以改进氨基酸发酵生产的一个方法是操作相应的ppc基因。例如，乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ppc基因的扩增显示改善脯氨酸和苏氨酸的生产。见Sano，K.等，Agric.Biol.Chem.51：597-599(1987)。

已开发了使用对反馈抑制不敏感的突变株进行氨基酸发酵有效生产的各种技术。但是，还没有利用来自植物的PEP羧化酶发酵生产天冬氨酸或谷氨酸家族氨基酸或利用整合至微生物染色体DNA中的棒杆菌ppc基因发酵生产相同家族氨基酸、且其中的PEP羧化酶基本不受乙酰辅酶A或天冬氨酸调节的报道。

美国专利4,757,009(Sano等；Ajinomoto公司)公开了一种通过发酵生产氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养携带含如下质粒、并具有编码氨基酸的染色体基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株，所述质粒中操作性地插入了编码PEP羧化酶的基因，其中该基因是从携带PEP羧化酶基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株分离的染色体基因；并从培养基中分离该氨基酸。从中分离PEP羧化酶编码基因的棒杆菌属或短杆菌属菌株是显示减弱的天冬氨酸反馈抑制的菌株。