[发明专利]运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法

摘要

涉及一种基因工程,从蓝藻Calothrix7601染色体DNA上PCR扩增出cpc2启动区、整合平台同源片段L和R,组装了含cpc2启动区、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因整合平台同源序列等元件的供体质粒pUTK,建立了Calothrix7601新的基因整合平台系统,获得转UBTα1基因的藻株,并从中检测到Tα1基因的表达产物。本发明以蓝藻作为新型基因工程受体和生物反应器,使人的Tα1基因在其中高效表达,以大量生产Tα1,具有很大的开发前景。

主权项

1．运用基因整合平台系统进行蓝藻转基因及表达胸腺素α1的方法，其特征在于按设计从蓝藻Calothrix7601染色体DNA上PCR扩增出藻蓝蛋白cpc2启动区、整合平台同源片段L和R，组装了含cpc2启动子、UBTα1目的基因、rbcS终止子、Kmr报告基因和基因平台同源序列等元件的供体质粒pUTK，建立了Calothrix7601新的基因整合平台系统，获得了转UBTα1基因的藻株，其具体方法步骤如下：(1)cpc2启动区(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆根据丝状蓝藻Calothrix7601的cpc2操纵子的启动区P以及同源片段L和R这三个片段两端的核苷酸序列分别设计三对PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下：P1(5’端引物)：5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’SalⅠP2(3’端引物)：5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphⅠL1(5’端引物)：5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EcoRⅠL2(3’端引物)：5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalⅠR1(5’端)：5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalⅠR2(3’端)：5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindⅢ其中启动区左端引物P2设计了一个SphⅠ酶切位点，其序列为GCATG↓C，以Calothrix7601的染色体DNA为模板，按常规的PCR技术分别扩增出0.6kb片段P，1.2kb片段L和1.2kb片段R；根据引物中的酶切位点，用SphⅠ和SalⅠ同时双酶切片段P和载体pUC19，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E．coliJM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCP；用HindⅢ和SalⅠ同时双酶切片段R和载体pUC19，然后用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coliJM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pUCR；用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切片段L和重组质粒pUCP后，用T4DNA连接酶连接，连接物转化受体菌E.coliJM101，用蓝白筛选得到白色克隆子，得重组质粒pULP；(2)外源供体片段DNA的克隆：a．卡那霉素-Kmr报告基因和rbcSpolyA终止区的克隆：选择含有报告基因卡那霉素-Kmr和终止区rbcSpolyA两个片段的质粒pKYLX71，用XbaⅠ和SalⅠ双酶切pKYLX71，胶回收4.8Kb的DNA片段，与经同样双酶切的重组质粒pUCR连接，连接物转化E.coliJM101，以含有Ap和Km的双抗培养基筛选，获得了8.7kb的重组质粒pUKR；b．目的基因UBTα1的获得及克隆：按Tα1基因的序列设计了以下PCR引物T1、T2和T2’：T1(5’端片段)：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphⅠBarnHⅠGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3(65Nts)T2(3’端片段)：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAACSpeⅠAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(65Nts)T2’(3’端引物)：为T2之5’端的前25个核苷酸以T1和T2为引物，按常规PCR扩增得Tα1片段，以质粒pUCUB为模板，引物为U1和U2，PCR扩增出UB片段，用BamHⅠ酶切Tα1和UB片段后连接，再以此连接物为模板，以U1和T2’为引物扩增获得UBTα1片段。用XbaⅠ和HindⅢ不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段，用SphⅠ和SpeⅠ双酶切目的基因UBTα1；用SphⅠ和HindⅢ双酶切pULP，将以上三种酶切片段混合后连接，转化，以Ap和Km双抗筛选，获得了供体质粒pUTK；(3)供体质粒pUTK电激转化Calothrix7601用EcoRⅠ完全酶切pUTK，获得线状质粒pUTK，在电压0.4～2.0kv，电阻100～200Ω，时间2.5～5.0ms、电容25μF的条件下电激转化蓝藻Calothrix7601，将经电激处理后的转化藻株经培养，以Km筛选，获得转UBTα1基因的藻株。