[发明专利]白细胞介素－2基因在慢性疼痛应用中的测试方法

摘要

本发明属基因工程技术领域。本发明公开了白细胞介素－2基因在慢性疼痛应用中的测试方法。通过采用腺病毒载体和pcDNA3质粒介导IL－2基因转移至蛛网膜下腔、病灶局部治疗慢性疼痛,用基因疗法使IL－2镇痛效应时间延长以达到实际应用的目的。

主权项

1、一种白细胞介素-2基因在慢性疼痛应用中的测试方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)pcDNA3-IL-2真核表达质粒的构建人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长的含信号肽的人IL-2cDNA，462bp，克隆入经相同酶切的pcDNA3载体，IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，构建的质粒转化入大肠杆菌JM109扩增，碱裂解法制备质粒，聚乙二醇沉淀法纯化，通过测定260nm的光吸收来确定质粒浓度，注射时质粒稀释于含5％葡萄糖的磷酸盐缓冲液中；(2)重组腺病毒Ad5-IL-2的构建人IL-2基因经EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接头的全长的含信号肽的人IL-2cDNA，462bp，克隆入经相同酶切的pCA13载体，IL-2基因在CMV启动子的控制下表达，pCA13-IL-2与腺病毒基因组质粒pBHG10共转染293细胞，进行同源重组，筛选重组腺病毒，扩增纯化腺病毒，注射时病毒稀释于含5％蔗糖的磷酸盐缓冲液中；(3)慢性神经病理痛模型的建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤建立慢性神经病理痛；(4)外周炎症痛模型的建立大鼠后肢跖部皮下注射角叉菜胶建立外周炎症痛模型；(5)pcDNA3质粒介导IL-2基因对慢性神经病理痛的影响大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤手术后30天，经第5与第6腰椎之间插入导管，鞘内分别注射5％葡萄糖PBS，50μglipofectamine，25μgpcDNA3，25μgpcDNA3/50μglipofectamine，10μgpcDNA3-IL-2，10μgpcDNA3-IL-2/20μglipofectamine，25μgpcDNA3-IL-2，25μgpcDNA3-IL-2/50μglipofectamine，n＝12-14，注射总体积为30μl，注射后每天测定伤害性辐射热所致缩腿反射潜伏期，连续7天；(6)腺病毒载体介导IL-2基因对慢性神经病理痛的影响大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤手术后2周，经第5与第6腰椎之间插入导管，鞘内分别注射5％蔗糖PBS，5×107pfuAd5，5×107pfuAd5-IL-2，n＝15-18，注射总体积为10μl，注射后每周测定伤害性辐射热所致缩腿反射潜伏期，连续5周；(7)pcDNA3介导IL-2基因对外周炎症痛的影响大鼠经第5与第6腰椎之间插入导管，鞘内或后肢跖部皮下注射5％葡萄糖PBS，50μglipofectamine，25μgpcDNA3，25μgpcDNA3/50μglipofectamine，10μgpcDNA3-IL-2，10μgpcDNA3-IL-2/20μglipofectamine，25μgpcDNA3-IL-2，25μgpcDNA3-IL-2/50μglipofectamine，n＝8-10，注射总体积为30μl，2天后大鼠相同后肢跖部皮下注射角叉菜胶，注射后2.5小时测定伤害性辐射热所致缩腿反射潜伏期；(8)统计方法采用单因素方差分析。