[发明专利]萝卜几丁质结合蛋白及其制备方法

摘要

本发明是以萝卜为材料,经壳聚糖亲和层析和离子交换柱层析,获得4种几丁质结合蛋白命为M1、M2、M3、M4。洗脱液分别浓缩或冻干制得上述4种萝卜几丁质结合蛋白制剂,均达到电泳纯度。M1、M2的溶菌酶活力6－7万U/mg蛋白质,几丁质酶活力24－47U/mL;M3、M4的几丁质酶活力为47－62U/mL。表明M1、M2是种双功能酶。M1、M2的相对分子质量分别为26915、24831。Asp、Glu、His、Trp是M1、M2活性所必需的氨基酸。萝卜几丁质结合蛋白对细菌G－及G+均有杀菌作用,同时对真菌、酵母和昆虫的细胞壁也起水解作用。在医药、食品、日化业及农作物病虫防治上具有广泛应用的良好前景。

主权项

1.萝卜几丁质结合蛋白其特征在于：该种几丁质结合蛋白有四种蛋白质，分别为蛋白质M1、蛋白质M2、蛋白质M3、蛋白质M4都为白色粉末，无毒、无味，易溶于水，其水溶液可达电泳纯：SDS-PAGE，具有蛋白质结构和性质，固体制品的灰分：常规法测定≤5％，水分：恒重法测定≤7％。M1和M2既具有溶菌酶活性活力，又具有几丁质酶活力，是双功能酶；M3、M4具有几丁质内切酶和外切酶活力。M1、M2的化学性质：M1、M2的相对分子质量分别为26915和24831，二者都不是糖蛋白，均不含Cys及链内和链间二硫键，均为单成分、单体蛋白质，它们的生物催化活性中心由Glu、Asp、His和Trp氨基酸残基组成；M1、M2、M3、M4的pI值为9.5-10；以溶壁微球菌为底物时，M1的Km值为0.287mg/mL、Vmax为666.67U/min，M2的Km值为0.1533mg/mL，Vmax为3333.33U/min；反应活化能M1为3945J/mol；M2为35786.01J/mol；M1反应的温度为45-60℃、反应的pH为5.0-7.0；M2的反应温度为35-55℃，反应的pH为6.0-8.0，M1、M2均在0-60℃、pH3.4-10.6范围内稳定。以N-乙酰葡萄糖胺为底物时，M1反应的pH为3.6-5.6、M2反应的pH为2.4-4.4；贮藏稳定性：M1、M2半衰期为180天，固体制剂年衰变率约为10％；0.002％NaClO和24％H2O2能使M1、M2失去活性；木瓜蛋白酶可使M1、M2失去活性，无机盐离子在50mmol/L的浓度下对M1、M2活性呈促进，在50mmol/L的浓度以上时表现为抑制作用，其中一价阳离子如Na+、K+、NH4+完全抑制的浓度为200mmol/L，二价阳离子如Ca2+、Co2+、Mn2+完全抑制浓度为50mmol/L，NO3-能缓解阳离子的抑制作用，N-乙酰葡萄糖对M1、M2为竞争性抑制，组胺对M1、M2为非竞争性抑制，His对M1，M2为反竞争性抑制剂，咪唑对M1、M2也有抑制作用；M1的溶菌酶活力为3.0-4.0万U/mg蛋白、几丁质酶活力为22-25U/mL，M2的溶菌酶活力为2.5-3.5万U/mg蛋白、几丁质酶活力为40-50U/mL，M3的几丁质酶活力为55-70U/mL，M4的几丁质酶活力为40-50U/mL。