[发明专利]检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒

摘要

本发明涉及检测临床生物样品中结核分枝杆菌的存在及其耐药基因突变的方法和试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测临床痰液、支气管灌洗液、血液、腹水、脑脊液等生物样品中结核分枝杆菌的存在及其耐药基因突变的方法和试剂盒。

主权项

1.一种检测临床生物样品中结核分枝杆菌及耐药基因突变的方法，该方法包括：(1)分离待检靶核酸样品；(2)聚合酶链反应扩增靶DNA片段；(3)使特异性寡核甘酸探针与靶核酸杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的rpoB基因、katG基因、inhA基因启动子区域和插入序列IS1081基因，特征在于巢式聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别为：rpoBF1：5′CGT CGA GGT GCC GGT GGA AAC 3′(SEQ ID NO：1)rpobR1：5′CAC CGA CAG CGA GCC GAT CAG 3′(SEQ ID NO：2)KatGF1：5′CTG GCT CGG CGA TGA GCG TT 3′(SEQ ID NO：3)KatGR2：5′AGG GCT CTT CGT CAG CTC CCA 3′(SEQ ID NO：4)inhAF1：5′AGG GCG TCA ATA CAC CCG CA 3′(SEQ ID NO：5)inhAR2：5′CGG ACC CTG GTG CTC TTC TA 3′(SEQ ID NO：6)IS1081F1：5’-CACTGCTCGGTGCTGTGGATT-3’ (SEQ ID NO：7)IS1081R1：5’-CACGGGTGTCGAAATCACGGT-3’ (SEQ ID NO：8)rpoBF2：5′GGTCGG CAT GTC GCG GAT G 3′ (SEQ ID NO：9)rpoBR2：5′GCA CGT CGC GGA CCTCCA G3′(SEQ ID NO：10)katGF2：5′GAAACAGCGGCGCTGGATCG3′(SEQ ID NO：11)katGR2：5′GTTGTCCCATTTCGTCGGG3′(SEQ ID NO：12)inhAF2：5′CCTCGCTGCCCAGAAAGGG 3′(SEQ ID NO：13)inhAR2：5′ATCCCCCGGTTTCCTCCGG 3′(SEQ ID NO：14)IS1081F2：5′TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3′(SEQ ID NO：15)IS1081R2：5′GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3′(SEQ ID NO：16)并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：1：5′CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：17)2：5′TTCATGGACCAGAACAACCCGC 3′(SEQ ID NO：18)3：5′AACCCGCTGTCGGGGTTGACC 3′(SEQ ID NO：19)4：5′TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：20)5：5′GCCGACTGTCGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：2 1)6：5′CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT 3′(SEQ ID NO：22)7：5′CTGAGCCCATTCATGGACCAG 3′(SEQ ID NO：23)8：5′GCCAATTCATGGTCCAGAACAACC 3′(SEQ ID NO：24)9：5′ACAACCCGCTGTTGGGGTTGA 3′(SEQ ID NO：25)10：5′TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：26)11：5′TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：27)12：5′TTGACCCGCAAGCGCCGACTGTC 3′(SEQ ID NO：28)13：5′CGCCGACTGTTGGCGCTGG 3′(SEQ ID NO：29)14：5′ACTGTCGGCGCCGGGGCC 3′(SEQ ID NO：30)15：5′ATCACCAGCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：31)16：5′ATCACCACCGGCATCGAGGTC 3′(SEQ ID NO：32)17：5′CGCGGCGAGACGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：33)18：5′CGCGGCGAGATGATAGGTTGT 3′(SEQ ID NO：34)19：5′CTTCTGGCTGACCAACTCGCA3′(SEQ ID NO：35)20：5′TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT 3’(SEQ ID NO：36)