[发明专利]一种体外定向进化获取高活力超广谱β－内酰胺酶的方法

摘要

本发明体外定向进化获取高活力超广谱β内酰胺酶的方法，属于医药生物工程技术领域，更具体地说主要采用了易错PCR和DNA改组这两种定向进化的策略，对本室构建的一株含TEM－1基因的菌株进行了改造。对突变菌株及其野生株进行酶的底物谱酶及其总活力进行比较，突变使原有的底物谱扩大，对代表性的第三代β－内酰胺抗生素头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)，头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)由不能降解提高到比活为43IU/mg和78IU/mg。

主权项

1.一种体外定向进化获取高活力超广谱β-内酰胺酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用PCR技术，以筛选的耐β-内酰胺抗生素的大肠杆菌总DNA为模板，设计引物，扩增获取β-内酰胺酶基因，插入pMD18T克隆载体上，转入E.coli JM109，测序鉴定为TEM-1基因。(2)配制易错PCR缓冲体系：在普通PCR反应底基础上添加MnCl2、MgCl2、KCl、明胶、dCTP、dTTP等物质。(3)把易错PCR产物及其pET24a表达载体用NdeI、XhoI双酶切后连接，连接产物转入E.coli BL21(DE3)构建易错PCR突变库， 采用抗生素筛选的方式获取对头孢他啶活性较高的菌株。(4)分别扩增获取活性提高的五株细菌的TEM-1突变基因，混合后用DNaseI消化，纯化回收50bp左右的DNA片段。(5)纯化的片段互为引物扩增，获得含较多突变位点基因，用NdeI、XhoI双酶切后连接同样双酶切的pET24a表达载体连接产物转入E.coli BL21(DE3)，构建DNA改组文库，采用抗生素筛选的方式获取对头孢他啶活性最高的菌株。(6)含重组质粒的E.coli BL21(DE3)发酵，获取的细菌溶于3倍体积的无菌PBS中进行超声破碎，获取超声上清。(7)超声上清中突变TEM-1酶的纯化采用亲和层析法，Ni亲和层析树脂结合突变TEM-1酶融合的His尾，得到纯度＞95％、高比活突变TEM-1酶。