[发明专利]稳定同位素18O标记蛋白质组双重定量方法与试剂盒

摘要

本发明提供了一种基于稳定同位素¹⁸O标记的蛋白质组双重定量的新方法。本方法是建立在N端肽段和C端肽段普遍标记的基础之上，通过¹⁸O化学标记与酶切标记结合的方法，可以实现对同一样本的两种¹⁸O标记的定量策略。该方法涉及蛋白质的还原烷基化和胰酶酶切、肽段的双功能试剂修饰和¹⁸O标记、多维液相色谱分离与多级串联质谱联用定量与鉴定。通过一级质谱峰峰面积来定量，蛋白质的鉴定通过串联二级质谱和数据库搜库。本发明还提供了便于该方法实施的试剂盒。

主权项

1.一种用于蛋白质组双重定量的稳定同位素18O标记蛋白质的方法，包括：(1)用还原剂打开蛋白质分子中的二硫键，破坏其高级结构；用烷基化试剂封闭巯基，防止其重新形成二硫键；(2)用化学消化或酶消化法对蛋白质进行消化，产生适于质谱分析的肽段；用试剂对酶切肽段的侧链氨基进行保护；(3)对肽段进行化学修饰和处理并进行质谱定量；其特征在于所述步骤(3)的处理方法为：(a)用一种或多种双酸酐试剂对肽段进行修饰，使其与肽段发生乙酰化偶合反应；(b)第一重定量标记为双酸酐试剂与肽段偶合反应的反应溶液分别为16O和18O碳酸氢三乙胺缓冲溶液；双酸酐试剂的一端发生偶合反应，另一端酸酐发生水解反应。修饰后的肽段中，反应体系在H2 18O配置的碳酸氢三乙胺缓冲溶液的肽段中引入了1个18O原子。(c)将等量的两种18O和16O标记的肽段经过沸水浴加热10分钟使胰蛋白酶灭活，然后等比例合并；(d)用色谱分离手段将合并肽段进行分离，用串联质谱来分析。进行质谱数据的定量分析及蛋白质的鉴定。