[发明专利]一种采用化学－酶法制备15N－L－酪氨酸的方法

摘要

本发明涉及一种采用化学－酶法制备¹⁵N－L－酪氨酸的方法，该方法包括以下工艺步骤：(1)菌体细胞的制备；(2)酶反应；(3)提取精制及¹⁵N的回收。与现有技术相比，本发明具有成本低廉，¹⁵N利用率高，通用性广，产品丰度下降少等特点。

主权项

1.一种采用化学一酶法制备15N-L-酪氨酸的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：(1)菌体细胞的制备a)发酵产酶所采用的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸细菌(Citrobacter frevndii)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；b)斜面培养：培养基为营养肉汁琼脂培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，氯化钠5.0，琼脂15.0，蒸馏水1.0L，pH7.0，定容至1.0L，分装，0.1MPa、121℃灭菌20分钟，菌种接入后28℃～32℃培养16～24小时；c)发酵培养：以碳源、氮源、无机物配置成发酵培养基，调节其pH值6～9，灭菌后接入斜面种子，于150～260rpm，32℃～40℃，培养16～24小时；装液量为50ml/500ml，灭菌条件为0.1MPa，121℃，20分钟；d)发酵液离心得湿菌体，经生理盐水洗涤离心后加入磷酸吡哆醛溶液活化1～3小时，备用；(2)酶反应底物反应液：底物4-羟基苯丙酮酸的浓度为0.2％～5％，加入金属离子及15N氮源后用氨水或NaOH调节pH值为7.5～8.5；将上述处理所得游离整体细胞作为酶源加入底物溶液中，菌体加入量0.5％～2.5％，在30℃～45℃下反应20～28小时，转速110～150rpm；(3)提取精制及15N的回收反应结束后，将酶反应液调pH至1～3后进行离心，上清液用乙酸乙酯等体积萃取3次，所得水相于旋转蒸发仪上赶酯浓缩，直至蒸干；然后加水溶解至体积为200～300ml，上732树脂柱，水洗后用0.05M～0.40M的NH4Cl洗脱，分别收集15N-L-酪氨酸和15N-L-天冬氨酸或15N-L-谷氨酸单斑，浓缩后再上柱除盐，洗脱得到各自的洗脱液；经赶氨浓缩，活性炭脱色后，用乙醇和水进行结晶；结晶液冷至室温后，放冰箱冷藏过夜，第二天抽滤得白色晶体，洗涤、抽干，将晶体刮入容器内，于50℃～60℃真空烘干；对产品进行纯度、丰度检测，纯度＜98.5％可再行重结晶，最终得到15N-L-酪氨酸产品及回收的15N-L-天冬氨酸或15N-L-谷氨酸。