[发明专利]单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法

摘要

本发明涉及一种单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法。该方法首先将红细胞花环试剂溶解，其次分离外周血淋巴细胞，用含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成淋巴细胞悬液，同时将致敏红细胞悬液用含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮得致敏红细胞应用液；然后将淋巴细胞悬液与致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，18～28℃下静置后离心，再在4℃静置15～45min；最后用带吸头的移液器吹吸混合悬液15或20次后推制成细胞涂片，经自然干燥、染色后用高倍镜计数。本发明与原McAb－A－E法相比具有检测过程简化、周期短、可量化控制、满足临床检测要求的特点。

主权项

1.单克隆抗体SPA红细胞花环法检测淋巴细胞亚群的方法，包括下述步骤：(1)在冻干抗体致敏红细胞花环试剂中加入0.5mL pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液或磷酸盐缓冲液，溶解成致敏红细胞保存液；(2)抽取静脉血，以1∶1～3的体积比加入pH值为7.0～7.4的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液，混匀后，加在淋巴细胞分离液上，淋巴细胞分离液的量与稀释血液的体积比为1∶2～3，在18～28℃温度下，以800～1200rpm的转速离心15～25min；取出单个核细胞，并对单个核细胞用无钙、镁汉克氏平衡盐溶液洗涤后离心，每次以400～600rpm的转速离心6～10min，弃上清；然后用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液配成400～600万/mL淋巴细胞悬液；(3)取致敏红细胞保存液，以400～600rpm转速离心6～10min后去上清，用pH值为7.0～7.4含20％新生小牛血清的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液悬浮，形成与所取致敏红细胞保存液等量的致敏红细胞应用液；(4)淋巴细胞悬液与致敏红细胞应用液以1∶1的体积比混合成混合悬液，在18～28℃温度下放置10min；以300～500rpm转速离心5min后在4℃静置15～45min；(5)用20μL或25μL容积的带吸头的移液器吹吸混合悬液20或15次；取混合悬液推制细胞涂片，自然干燥后用改良姬姆萨染色法染色，然后用高倍镜计数：淋巴细胞周围黏附有三个以上红细胞即为花环阳性细胞，未黏附红细胞者为阴性细胞，黏附一、二个红细胞者除掉不计；计数时，选取细胞涂片从头至尾的2/6～4/6之间至少两处区域共计数200个细胞，算出花环形成细胞的百分率。