[发明专利]一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法

摘要

一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备与使用方法，属于生物技术领域。本发明涉及应用可特异性识别藻毒素的抗体来制备一种藻毒素免疫亲和层析填料和免疫亲和层析柱及其使用方法。其目的是为了方便从水、水产品、藻类及其制品的提取液中“一步法”富集纯化藻毒素，纯化后的样品进HPLC或LC－MS等进行定性定量分析。本发明中所制备的藻毒素免疫亲和层析柱对一种藻毒素特异性强，纯化效果显著，明显优于现有的固相萃取方法。该藻毒素免疫亲和层析柱提高了富集和纯化的效率，从而提高了检测方法的灵敏度和准确性，制备方法简单，可重复使用。

主权项

1.一种藻毒素免疫亲和层析柱的制备方法，其特征是制备步骤如下：(1)将所需量的藻毒素抗体：单抗或多抗，溶于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中，每毫克藻毒素抗体冻干粉末用10-50mL缓冲液溶解；(2)称取适量溴化氰活化的琼脂糖冻干粉末，用适量1mM的稀盐酸使其溶胀，然后在烧结玻璃滤器上冲洗以除去杂质，1g琼脂糖干粉溶胀为3.5mL凝胶，1mL琼脂糖凝胶结合0.5-10mg抗体；(3)将溶胀后的琼脂糖凝胶在pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液中与(1)制备得到的抗体溶液均匀混合，并在室温下震荡充分反应1-3小时，或在4℃下过夜；(4)用pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3缓冲液洗去未与琼脂糖凝胶结合的游离抗体，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；(5)将琼脂糖-抗体偶联复合物转入pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液，或pH8.0的含0.5M NaCl的1M乙醇胺溶液中，保持1-3小时，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；(6)步骤(5)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用不少于5倍载体体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液洗，和用不少于5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl洗，此洗涤过程重复三次；(7)防腐处理：步骤(6)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存，待用；(8)装柱：将步骤(6)或(7)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入层析柱或固相萃取空柱管中，即制成藻毒素免疫亲和层析柱；(9)保存：琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的藻毒素免疫亲和层析柱切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内，1年之内性能稳定；(10)柱的再生：用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗免疫亲和层析柱2次，再用PBS缓冲液充分平衡免疫亲和层析柱后保存在4℃冰箱内供下次使用，免疫亲和层析柱经过再生后可再次使用，每根免疫亲和层析柱可反复再生使用5-10次。