[发明专利]PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法

摘要

本发明公开了一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法，包括环状磷酸接头－1连接、单引物PCR扩增、III型限制性内切酶消化、粘性补平、与环状磷酸接头－2连接、双引物PCR扩增、FokI消化、克隆到表达载体等步骤。本发明解决了以III型限制性内切酶介导的PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法，由此产生的siRNA功能片断可控性的分布在19－23bp，这样可完全模仿体内自然的siRNA分子长度多样性，适用于RNAi基因治疗最佳靶点的筛选，克服了目前其它siRNA分子库构建方法存在的瓶颈和盲点。

主权项

1.一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库的制备方法，其特征是：为依次包括下列步骤和结构：(1)将起始DNA在Mn2+的缓冲体系中用DNAse I行不完全消化，消化后的DNA和产生16-23bp的siRNA环状磷酸接头-1进行平端连接；结构上，各环状磷酸接头-1都包含一个III型限制性酶切位点，该位点的近端即近接头平端，与多聚A/T序列相接续，远端即近发夹环部，与一个II型限制性酶切位点相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目，可以控制各环状磷酸接头-1中的III型限制性酶切长度，使siRNA长度呈可控性分布，远端II型限制性酶切位点能介导多聚A/T的克隆方式，一旦克隆能产生U6和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号，去除启动子和siRNA之间多余的克隆位点序列；所述的环状磷酸接头-1的通式为：5’pC(n)TTTTN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环3’G(n)AAAAN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环上述P：磷酸键；N：G，C，T，A任意碱基；n：碱基数(0-20)，可计算上述两种限制性内切酶的距离相应调整；(2)以上述平端连接反应后的产物为模板，用环状磷酸接头-1的反义链序列为引物进行“单引物”PCR扩增，选择性扩增两个对立而置的III型限制性酶切位点分子，使之能被III型限制性酶消化；(3)PCR产物用III型限制性内切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；(4)上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下补平，然后与磷酸接头-2进行平端连接。该接头包含一个II型限制性内切酶消化位点(与磷酸接头-1产生相同的粘端)，为进行克隆所用；(5)将经步骤(4)平端连接后的产物用5’(磷酸接头-1)和3’磷酸接头-2)引物进行PCR扩增；(6)纯化PCR产物后进行II型限制性内切酶消化，两侧产生AAAA粘端；(7)分离目的片段后，克隆到带有T5/A1粘端的表达载体构建siRNA分子库或miRNA(microRNA)分子库；前者带有U6和H1双启动子，表达双链的siRNA；后者为U6或H1单一启动子，表达单链的miRNA。一经克隆能产生U6或/和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号。