[发明专利]基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法

摘要

本发明涉及一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，扩增目标核酸的引物与模板完全配对，5＇端第10－30位含有1－5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10－30个核苷酸。等温PCR反应组分包括dI修饰的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、dATP、dTTP、dCTP、dGTP共4种脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶。等温PCR混合物经过最初的热变性、杂交退火后，在恒定温度下进行PCR。扩增过程中由内切核酸酶V实现引物－模板复合物的循环再生，引发DNA合成反应；单链DNA结合蛋白与解螺旋酶可提高等温PCR效率。本发明目标核酸的扩增不依赖于热循环仪，操作简便，可用于目标核酸的大规模高产量扩增。

主权项

1.一种基于dI修饰引物和内切核酸酶V的等温PCR核酸扩增方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计合成用于扩增目标核酸的正向与反向引物序列，正向引物与反向引物的序列特征是：整条引物与目标核酸模板分子完全配对，5’端第10-30位含有1-5个dI核苷酸，dI核苷酸下游具有10-30个核苷酸；2)将用于扩增目标核酸片段的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子、以及dATP、dTTP、dCTP、dGTP共四种脱氧核糖核苷三磷酸加入聚合酶链式反应缓冲液，配置成无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物；将DNA聚合酶、内切核酸酶V、单链DNA结合蛋白和解螺旋酶共四种蛋白质，以1-5个单位：5-500纳克：50-10000纳克：5-500纳克的比例混合，根据四种蛋白质的热稳定性，配成等温聚合酶链式反应常温蛋白混合物或等温聚合酶链式反应耐高温蛋白混合物；3)将无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物在95度热变性5-10分钟，然后降温至25-37度范围内放置5分钟，进行引物与目标核酸模板分子的杂交退火，形成引物-模板复合物；然后加入等温聚合酶链式反应常温蛋白混合物，于25-37度范围内进行等温聚合酶链式反应，反应时间1-24小时；或者，将无蛋白组分的等温聚合酶链式反应混合物与等温聚合酶链式反应耐高温蛋白混合物直接混合在一起，在95度热变性5-10分钟，然后降温至42-72度范围内进行等温聚合酶链式反应，反应时间1-24小时；4)将等温聚合酶链式反应后的混合物置于质量浓度为1％的琼脂糖凝胶中，200V条件下电泳20分钟，检测目标核酸扩增产物。