[发明专利]一种检测多倍体植物基因单核苷酸点突变的方法

摘要

本发明公开了一种检测多倍体植物基因单核苷酸点突变的方法，其步骤是：首先所用材料为具多基因系统的水田杂草鸭舌草；第二是选择ALS1基因和ALS3基因；第三是提取总DNA后，用仅对两个目标基因/ALS1和ALS3具特异性的引物，进行PCR扩增；第四是将PCR扩增产物通过变性、退火，得到异源双链核酸分子；第五是用特异识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子；第六是变性处理后用遗传分析系统进行双色聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别得到两张图；第七是该个体为变异型时，设计引物，进行筛选，检测发生变异的基因，并进行测序验证；第八是没有检测到变异，为野生型。本发明方法易行，操作简便，且有较好的检测点突变的效果，具有百分之百的可重复性。

主权项

1、一种检测多倍体植物基因单核苷酸点突变的方法，包括下列步骤：A、所用材料为多基因系统的水田杂草鸭舌草，用DNA提取试剂盒从鸭舌草中提取总DNA；B、设计对基因系统/ALS1、ALS2、ALS3和ALS4内的两个目标基因/LS1和ALS3具特异性的一对引物，其序列分别为：TCTGCATCGCCACCTCG和TGAAGCAGATGGAGG GCAGG，行First PCR扩增/两条引物分别用700nm和800nm萤光染色标记，其标记序列分别为gctacggactgacctcggac和ctgacgtgatgctcctgacg，顺向引物序列为：gctacggactgacctcggacTCTGCATCGCCACCTCG，反向引物序列为：ctgacgtgatgctcctgacgTGAAGCAGATGGAGGGCAGG；C、所设计的引物仅对两个目标基因/ALS1和ALS3具特异性，扩增到的PCR产物中既有ALS1基因也有ALS3基因；D、First PCR反应完成后，往PCR管内加90μl灭菌蒸溜水与PCR产物混合，然后将PCR管内的混合物全部转入到密理博96孔滤膜板内，在室温条件下抽真空干燥，抽干后再加120μl灭菌蒸溜水到密理博96孔滤膜板的各孔内，再次抽真空干燥，最后再加30μl灭菌蒸溜水到各个孔内，置摇荡器上摇荡；E、将以上纯化了的PCR产物稀释1/20倍/5μl纯化后的PCR产物+95μl灭菌蒸溜水，用做Second PCR的Template DNA；F、接着进行Second PCR，萤光引物被使用，在操作过程中避免光照；G、接着将PCR扩增产物通过变性、退火，得到由两个目标基因/ALS1基因和ALS3基因序列所形成的异源双链核酸分子；再用特异识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子；H、变性处理后采用DNA遗传分析系统进行双色聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别得到700nm和800nm两张图；其后分别设计两个目标基因中的一个基因/ALS1或ALS3具特异性的引物，再次进行筛选，检测出发生变异的基因，并对PCR产物进行测序验证，以确认变异是发生在ALS1基因上还是发生在ALS3基因上。