[发明专利]抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法，其步骤是：用人外周血T淋巴细胞或人胸腺细胞免疫健康猪，采集、分离出猪血浆，经20％乙醇制作后，用低温高转速离心机或压滤机分离出组分I+II+III沉淀，经14％乙醇制作后，分离、收集上清液，再经25％乙醇制作后，分离出组分II沉淀，再经过免疫球蛋白的精制、配置和病毒灭活等步骤即得抗人T细胞猪免疫球蛋白。与目前使用的硫酸铵盐析法相比，本发明工艺具有可大量生产、操作简单易于掌握、生产周期短、使用试剂少、成本低、无环境污染等优点，克服了现有工艺存在的难以大规模生产、产量低、浪费大、造成环境污染、生产成本高、生产过程复杂、使用的化学试剂繁多、生产周期长、设备占用率高等不足。

主权项

1.一种抗人T细胞猪免疫球蛋白纯化工艺，包括以下步骤：(1)制备免疫血浆：用人外周血T淋巴细胞或人胸腺细胞免疫健康猪，经检验合格后采集、分离出猪血浆；(2)20％乙醇制作：精确称量猪血浆量，倒入不锈钢大罐中，启动搅拌桨缓慢搅拌，按血浆量加入20％～30％的0.85％的生理氯化钠溶液，搅拌均匀，加入pH4.0的醋酸盐缓冲液调整混合溶液的pH值为6.0±0.50，再将混合液的温度降至-4.0℃±-1.0℃，加入95％的乙醇，乙醇温度不低于-25℃，加完乙醇，继续搅拌2小时后，停止搅拌静置8小时；(3)组分I+II+III沉淀分离：用低温高转速离心机或压滤机分离出组分I+II+III沉淀，上清液废弃；(4)14％乙醇制作：将组分I+II+III沉淀倒入装有温度低于4℃的注射用水的大罐中，缓慢搅拌，注射用水用量为投浆量的0.9倍，连续搅拌2小时后，加入磷酸盐缓冲液I调整pH值为5.0±0.50，持续搅拌1小时，再补入低于4℃的注射用水，注射用水用量为投浆量的1.3倍，加入磷酸盐缓冲液II调整pH值为6.0±0.50，持续搅拌1小时，再补入温度低于4℃的注射用水，注射用水用量为投浆量的1.7倍，将混合液温度降至-2℃±-1.0℃，加入95％的乙醇，乙醇温度不低于-25℃，加完乙醇，继续搅拌2小时后，停止搅拌静置8小时；(5)组分I+III沉淀分离：用低温高转速离心机或压滤机分离、收集上清液；沉淀为组分I+III，废弃；(6)25％乙醇制作：精确计量上清液体积，加入3mol/L氯化钠溶液，加入量为上清量的0.0167倍，再加入lmol/L碳酸氢钠溶液调整pH为7.0±0.50，将混合液温度降至-7.0℃±-1.0℃，加入95％的乙醇，乙醇温度不低于-25℃，加完乙醇，继续搅拌2小时后，停止搅拌静置8小时；(7)组分II沉淀分离：用低温高转速离心机或压滤机分离出组分II沉淀，上清液废弃；(8)免疫球蛋白精制：用0℃的0.85％的生理氯化钠溶液溶解组分II沉淀，生理氯化钠溶液用量为组分II重量的3～5倍，缓慢搅拌2小时，使沉淀均匀浆化，开始澄清过滤，然后超滤脱醇，取样测蛋白浓度，根据测定的蛋白浓度的结果将蛋白浓度稀释至1％，加入经醛化的人红细胞，加量为投浆量的15％～30％，放置4℃冷库缓慢搅拌，冷吸收8～10小时，离心取上清，上清中加入经醛化的人胎盘渣和健康人血浆，胎渣加量为投浆量的15％～30％，健康人血浆加量约为投浆量的5％，放置4℃冷库缓慢搅拌，冷吸收8～10小时，然后将胎盘渣过滤出除；(9)免疫球蛋白的配置：将滤液超滤浓缩，使蛋白含量为3.5％～5.5％，按浓缩液体积的5～6倍配置0.85％的生理氯化钠溶液，对浓缩液进行超滤透析，透析完毕用1mol/L盐酸调整pH至4.00±0.30，按液体总量的90～110g/L比例加入麦芽糖，搅拌使其溶解完全；(10)免疫球蛋白的病毒灭活：组装除病毒过滤器，再将除病毒过滤器经121℃30分钟以上湿热灭菌，盛装除病毒后制品的关闭瓶须先经180℃2小时以上干热灭菌；然后将配置好的免疫球蛋白经除菌滤器过滤至关闭瓶中，并取样做半成品检定；过滤完毕将关闭瓶放置定温室内，进行低pH病毒灭活，温度为24±1℃，孵放24天，即得澄清无混浊状的抗人T细胞猪免疫球蛋白。